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血管生成是肿瘤赖以生长和转移的基础。在正常生理条件下，新生血管的形成受体内调控机制的严格控制。与此相反，在肿瘤组织中，血管生成过程失控。一旦新生血管形成的程序启动，此过程将无限期持续。肿瘤血管生成是一个十分复杂的过程，众多的血管生成调控因子以及多条信号通路参与该过程的调控。近年来的研究结果表明，Notch信号通路在肿瘤血管生成过程中发挥重要的作用。应激反应（stress）是指机体受到有害刺激（如创伤、手术、失血、感染、中毒、缺氧、饥饿、抑郁、焦虑等）时，产生的一系列非特异性的心理与生理反应。机体处于应激状态时，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴活动增强，从而引起机体内多种应激反应相关激素（例如儿茶酚胺和糖皮质激素等）的水平发生变化。最近的研究揭示，应激反应相关激素儿茶酚胺在肿瘤新生血管形成过程中发挥重要的调控作用。实验研究结果表明，慢性束缚应激可导致动物体内儿茶酚胺（肾上腺素或去甲肾上腺素）水平升高，并可显著增加小鼠卵巢癌移植瘤组织中的血管密度。我们的研究以及其它研究小组的工作证实，儿茶酚胺可在多种肿瘤细胞中诱导VEGF的表达，促进肿瘤新生血管形成，而β-肾上腺素能受体（β-AR）阻滞剂能有效逆转慢性应激诱导的血管形成，提示儿茶酚胺和β-AR介导的信号通路与肿瘤血管生成密切相关。然而，儿茶酚胺和β-AR信号通路活化调控肿瘤血管生成的分子机制尚不完全清楚。在本项研究中，我们揭示了儿茶酚胺调控肿瘤血管生成的一个新机制，即儿茶酚胺激活β2-AR-PKA-mTOR信号通路，诱导乳腺癌细胞Jagged-1表达上调，进而激活与肿瘤细胞相邻的血管内皮细胞中Notch信号通路活化，从而促进了肿瘤新生血管生成。主要的研究结果如下。1.儿茶酚胺通过旁分泌非依赖性途径诱导肿瘤新生血管形成。应用去甲肾上腺素（NE）刺激乳腺癌细胞系MDA-453，在刺激后不同时间点收集细胞，提取细胞总RNA，通过半定量RT-PCR法分析NE诱导VEGF mRNA表达水平的变化。实验结果表明，NE可显著增强MDA-453细胞的VEGF表达。收集经NE刺激的MDA-453细胞的培养上清，用以处理人脐静脉血管内皮细胞HUVEC。通过体外血管形成实验，发现NE刺激后的肿瘤细胞培养上清可显著增强HUVEC形成血管样结构，提示NE可能通过刺激肿瘤细胞表达VEGF、以旁分泌的形式调控肿瘤血管生成。有趣的是，当我们将MDA-453细胞与HUVEC共培养时，发现NE可更为有效地促进HUVEC形成血管样结构，且血管样结构的数量和结构的完整性均明显超过肿瘤细胞培养上清的作用。我们又以乳腺癌细胞细胞系MCF-7和MDA-231为模型细胞，亦获得了相似的结果，提示儿茶酚胺除通过诱导VEGF表达、产生旁分泌形式的促血管生成效应外，其它途径亦参与了NE诱导的肿瘤血管形成过程。2.儿茶酚胺调控乳腺癌细胞与血管内皮细胞间Jagged-1/Notch信号。我们用Notch报告载体pGA981-6转染HUVEC。将转染细胞与MCF-7细胞共培养，并在混合培养体系中加入NE刺激。应用双荧光素酶活性测定分析了NE刺激对HUVEC中Notch活化的影响。实验结果表明，NE刺激对单独培养的HUVEC中Notch报告基因活性不产生明显的影响。而当HUVEC与MCF-7细胞共培养时，NE则可显著地诱导HUVEC中Notch报告基因的活性。我们又在乳腺癌细胞系MDA-453中对这一现象进行了验证。结果表明，NE诱导HUVEC中Notch活化依赖于肿瘤细胞的存在，推测NE可能通过诱导肿瘤细胞表达Notch受体的配体，从而导致血管内皮细胞中Notch信号通路活化。因此，我们应用儿茶酚胺刺激多种乳腺癌细胞，通过Western blot分析了细胞中Notch配体的表达。结果显示，儿茶酚胺可在多种乳腺癌细胞中上调Notch配体Jagged-1表达。敲低乳腺癌细胞中Jagged-1的表达可显著抑制NE诱导的HUVEC中Notch的活化。这些结果提示，儿茶酚胺可能通过调控乳腺癌细胞与血管内皮细胞间Jagged-1/Notch信号，从而影响肿瘤血管形成。3.儿茶酚胺通过激活乳腺癌细胞中β2-AR-PKA-mTOR信号通路上调Jagged-1的表达。我们应用实时定量RT-PCR法，检测了儿茶酚胺诱导后乳腺癌细胞中Jagged-1mRNA表达的变化。实验结果表明，在多种乳腺癌细胞中，儿茶酚胺均可在转录水平显著上调Jagged-1的表达。体内实验的结果亦证实，异丙肾上腺素（ISO）慢性刺激可显著诱导移植瘤组织中Jagged-1在mRNA和蛋白水平的表达。同时，ISO慢性刺激组的移植瘤组织中，CD31阳性的血管结构显著增多。应用JAG1启动子报告载体和双荧光素酶活性测定，观察到NE可通过增强JAG-1启动子活性，上调Jagged-1mRNA的表达。β2-AR、PKA及mTOR特异性抑制剂均可有效抑制NE诱导的肿瘤细胞Jagged-1表达上调，表明β2-AR-PKA-mTOR信号通路介导了儿茶酚胺诱导的乳腺癌细胞中Jagged-1表达上调。4.儿茶酚胺通过诱导肿瘤细胞与血管内皮细胞间Jagged-1/Notch信号，调控肿瘤血管生成。应用NE刺激MDA-453细胞后，用无酶消化液消化并收集细胞，将其与HUVEC共培养，进行体外血管生成实验。实验结果表明，NE刺激的MDA-453细胞能强有力地促进HUVEC血管样结构形成。而且，NE刺激的MDA-453细胞可更为显著地激活HUVEC中Notch信号通路的活化。我们又以乳腺癌细胞MDA-231细胞为模型对这一现象进行了验证，获得了相似的实验结果。为了进一步验证Jagged-1在血管形成中的作用，我们在乳腺癌细胞中过表达Jagged-1，并将过表达Jagged-1的乳腺癌细胞与HUVEC共培养。实验结果表明，过表达Jagged-1的乳腺癌细胞可显著促进血管生成；而在乳腺癌细胞中敲低Jagged-1的表达，不仅可抑制NE诱导的HUVEC中Notch信号通路的活化，而且可显著抑制NE诱导的HUVEC血管样结构形成。综上所述，本研究首次报道：1.儿茶酚胺可通过乳腺癌细胞与血管内皮细胞接触依赖途径促进肿瘤血管形成；2.在乳腺癌细胞中，儿茶酚胺激活β2-AR-PKA-mTOR信号通路，从而在转录水平和蛋白水平上调Jagged-1的表达；3.儿茶酚胺通过调控肿瘤细胞与血管内皮细胞间Jagged-1/Notch信号通路促进肿瘤血管生成。