本课题以单链抗体为研究中心，围绕喹噁啉类和大环内酯类药物开展了相关的基因工程抗体研究。　　1.喹噁啉类药物残留标示物特异性单链抗体研究以MQCA和QCA为半抗原，对氨基苯甲酸和氨基丁酸为连接臂合成了4种完全抗原。合成新的半抗原喹噁啉衍生物喹噁啉-2,3-二羧酸，以此为半抗原合成新完全抗原，经紫外图谱验证，证明抗原合成成功。采用多种抗原免疫小鼠，免疫监测结果显示，抗体对MQCA和QCA的苯胺衍生物具有一定的灵敏度，对MQCA和QCA原形不灵敏。将MQCA和QCA标记在Dynal氨基化磁珠上，实现了特异性B细胞的分离。Trizol一步法提取脾细胞总RNA并反转录成cDNA。PCR方法扩增VH和VL片断，通过体外重组方法得到完整ScFv。SfiI和NotI限制性内切酶将ScFv双酶切，与pCANTAB5E载体连接，通过电转化技术将载体导入E.coli TG1菌株，构建了喹噁啉类残留标示物亲和纯化文库和对照文库，库容量分别均大于107。采用pH2.2 Gly-HCl溶液和竞争洗脱的方法筛选特异性抗体，均未从文库中得到喹噁啉类药物残留标示物特异性单链抗体。　　2.大环内酯类药物单链抗体研究为了研究噬菌体抗体文库技术能否从脾细胞抗体文库中得到特异性单链抗体，选择了吉他霉素做为目标药物进行实验。以O-羧甲基羟胺（AOAA）为间隔臂，将吉他霉素与戴诺氨基化磁珠偶联制备吉他霉素标记磁珠。将磁珠与免疫小鼠脾细胞孵育，富集了吉他霉素特异性脾细胞。利用建立的噬菌体抗体展示技术路线，构建了吉他霉素亲和筛选文库和对照文库，库容量分别为1.3×107、1.5×107。吉他霉素包被原包被免疫试管，筛选吉他霉素特异性噬菌体抗体，吉他霉素溶液竞争洗脱结合的噬菌体抗体，经过3轮筛选，成功获得了对吉他霉素具有高灵敏度的噬菌体抗体。两种抗体对吉他霉素半数抑制率IC50分别为6.9、15.6μg/L。　　为了研究不同抗体在基因--水平和蛋白质水平的差异，实验中构建了大环内酯类药物特异性细胞株OA/1B6、DH/2G11、DH/5F11、DA/4E2、DA/3C4、KA/1H8和KA/2A9噬菌体抗体文库，筛选特异性抗体，结合抗体采用pH2.2 Gly–HCl溶液洗脱，成功获得特异性噬菌体抗体。将特异性噬菌体抗体感染E.coli HB2151菌株，得到相应的可溶性表达菌株和ScFv，ELISA实验结果显示体外表达ScFv具有与单克隆抗体相近的灵敏度和特异性。　　为了探索ScFv检测动物组织中药物残留的能力，我们选择DA/3C4 ScFv建立间接竞争一步法ELISA，研究了方法检测猪肌肉组织中泰乐菌素残留的能力。实验结果表明泰乐菌素在猪肌肉组织的添加回收率在70~120%之间，满足兽药残留检测的要求，证明ScFv能够用于检测动物可食性组织中的药物残留。表达菌株质粒保存稳定性实验结果显示，在有抗性选择压力和无抗性选择压力的条件下，可溶性表达菌株DA/3C4/Z79连续传10代，表达质粒无明显丢失，但是菌株表达抗体水平会下降。抗体稳定性实验结果表明，ScFv在4℃保存随着时间的延长活性逐渐降低，-20℃能稳定保存3个月以上。　　本研究获得了7种大环内酯类药物特异性ScFv序列，采用生物信息学工具对序列同源性进行分析。所有单链抗体均检索到高度同源的胚系基因序列，证明大环内酯类抗体产生途径主要是氨基酸重排和替换，插入突变较少。我们利用分子结构模拟软件预测DA/3C4 ScFv三维结构，并对抗体与药物复合体进行了模型构建和分析。表明DES与DA/3C4的结合是大环内酯环、5位氨基糖和23位阿洛糖的部分结构共同作用的结果。210位SER和93位ASN分别前后两端以氢键的形式与DES大环内酯环。　　3吉他霉素ELISA检测试剂盒制备在吉他霉素单链抗体研究的基础上，本研究制备了一种能够检测动物可食性组织中吉他霉素残留的酶联免疫检测试剂盒。以吉他霉素为半抗原，O-羧甲基羟胺（AOAA）为间隔臂与牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联，成功合成了吉他霉素完全抗原。以OMT为原料，合成了衍生物23-amino-OMT，以戊二醛做为连接臂与蛋白偶联，合成了23-amino-OMT完全抗原。将完全抗原免疫Balb/c小鼠。血清效价检测结果显示，吉他霉素完全抗原免疫小鼠血清具有高效价和高灵敏度，23-amino-OMT-BSA抗原免疫小鼠血清只能识别泰乐菌素和替米考星，对其他药物无识别能力。　　采用杂交瘤细胞融合技术，将免疫效果良好的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合率在70%以上。采用间接竞争ELISA方法筛选阳性孔，对具有高OD值和灵敏度的阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆建株。经过4~5次亚克隆，成功建立了KA/1H8和KA/2A9杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性实验结果显示，KA/2A9细胞株具有稳定分泌抗体的能力。杂交瘤细胞染色体计数结果显示杂交瘤细胞平均染色体数为96.9，总数与脾细胞和瘤细胞染色体总数相近。　　小鼠体内诱生法制备了单克隆抗体腹水，间接ELISA检测结果显示KA/1H8、KA/2A9腹水效价分别为6.4×105、8×104，对吉他霉素灵敏度IC50分别为13.9和5.7μg/L。亚型鉴定结果显示，两细胞株分泌抗体亚型均为IgG1。抗体交叉反应率测定结果显示，KA/2A9对麦迪霉素和交沙霉素的交叉反应率分别为5.7%和57%，KA/1H8对上述药物的交叉反应率分别为20.6%和50%。　　研究中以KA/2A9抗体建立了吉他霉素的间接竞争ELISA方法，标准曲线回归方程为y=-0.610+0.995，相关指数r=0.997，标准曲线半数抑制率IC50值为5.7±1.4μg/L（n=5），线性范围为1.25～20μg/L。研究中建立了猪、鸡肌肉和肝脏中吉他霉素提取方法，组织样品处理方法为：组织样品用含40%甲醇的0.3%偏磷酸溶液提取后，三氯甲烷萃取，氮气吹干，残留物用PBS溶解后，用建立的ELISA方法对处理样品进行检测。ELISA方法对猪肌肉和肝脏最低检测限分别为22.47、22.32μg/kg，对鸡肌肉和肝脏最低检测限分别为14.34、15.11μg/kg。猪和鸡肌肉，肝脏中吉他霉素的添加回收率均值在70%~120%之间，批内和批间变异系数均﹤20%。动物药物喂养实验结果显示，ELISA检测结果与HPLC-MS/MS结果具有较好一致性，建立的ELISA方法能够用于检测动物可食性组织中吉他霉素残留。　　4泰乐菌素和替米考星ELISA试剂盒完善以本实验室研制的泰乐菌素和替米考星多特异性单克隆抗体建立ELISA检测方法，并组装成试剂盒。实验中建立了适用于商品化试剂盒的替米考星间接竞争ELISA方法，标准曲线在2.5～40μg/L浓度范围内呈线性，回归方程为y=-0.452x+0.989，相关系数r=0.997，IC50=12.07μg/L。　　肌肉（牛、羊、猪、鸡、鱼）、肝脏（牛、羊、猪、鸡）、牛奶、蜂蜜、鸡蛋中泰乐菌素和替米考星提取方法为：组织样品用含40%甲醇的0.3%偏磷酸溶液提取后，取部分上清，调节pH值，三氯甲烷反萃取，氮气吹干，残留物用pH6.0 PBS溶解后，正己烷去脂，用建立的ELISA方法对样品进行检测。建立的组织提取方法适用于11种动物源性食品中泰乐菌素和替米考星提取。ELISA方法最低检测限小于20μg/kg，添加回收率均值在70%～120%之间，批内和批间变异系数均﹤20%，满足残留限量检测要求。