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超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是一类由细菌质粒介导的，能水解氧亚氨基β-内酰胺类抗生素如：头孢噻肟(CTX)、头孢他定(CAZ)、头孢曲松(CRO)等三代头孢菌素和氨曲南(ATM)等单环酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是主要的产ESBLs菌。迄今为止，已发现ESBLs超过150多种，且新基因型种类在不断增加。根据分子结构同源性及底物的不同，ESBLs主要分为SHV，TEM，CTX-M，OXA和其他型ESBLs。自90年代以来，产ESBLs菌检出率不断增加，是医院感染的主要因素。因为不同基因型的ESBLs理化特性和耐药性有所不同，而不同地区流行的基因型也不尽相同，所以了解不同地区的流行基因型对指导产ESBLs菌感染的药物治疗及流行控制有重要意义。我们对2000-2001年杭州市分离的产ESBLs菌株耐药情况及基因型分布进行了研究。 1．材料与方法 1．1细菌来源 收集2000年11月至2001年6月间杭州市五家医 浙江大学硕士学位论文 院病房临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共！98株，根据临床资料 剔除重复菌种，其中大肠埃希菌127株，肺炎克雷伯菌刀株。细菌均 用法国梅里埃公司API鉴定条重新鉴定。标本来源：尿95份，痰59 份，脓性分泌物 20份，咽拭子 8份，其它 16份（包括血液 4份，胆汁 3份等）。 1．2 ESBLS的检测 采用美国临床实验室标准委员会 NCCLS 999 年推荐的酶抑制剂增强纸片扩散试验。 1．工 且初筛实验：用分别含抗生素CTXu0％＊CAZO0tyL CRO（30t＊ ATMu0％）纸片做药敏试验，药敏试验按KirbyBauer 法操作。结果按NCCLS1999年标准解释判断，筛出可疑的BLS产生株。 1．2．2确证实验：头抱他陡、头抱他陡／克拉维酸（CDZ，30／10）、 头抱噬躬、头抱噬侗克拉维酸（CD3，30／10）纸片作药敏试验，按 D巾yBauer法操作，单药纸片（CAZ、CTX）和与相应的（CDZ、CD3） 中任何一对的抑菌圈直径之差35为ESBLS产生株。用大肠埃希菌 ATCC25922和标准产酶大肠埃希菌（分别产TEM－26和SHV－7型p－ 内酞胺酶）作为质控菌。 1．3 药敏实验 琼脂稀释法测定产 ESBLS菌株对头抱唆肪（CTX） 及头抱他陡（CAZ）的最低抑菌浓度（MIC），以大肠埃希菌ATCC25922 和肺炎克雷伯菌ATCC35218为质控菌株，按NCCLsl999年标准解释结 果。 1．4o－内酞胺酶等电点测定 参照Matthew等方法，提取产 ESBLS细菌6－内酞胺酶的粗提物，在落层聚丙烯酞胺凝胶OH3－9）上进 行等电聚焦电泳，再用浸有0刀5％Nitrocrphin滤纸进行染色。用TIM上 （pIS．4），TIM43（pI6．l），SHV－3（pI7刀），SHV－2（pI7石），SHV－5 … 刀L ACT…．0）制作标准曲线，作为等电点判定的标准。 2 浙江大学硕士学位论文 1．5 PCR扩增 根据 TEM．l，SHV．l，OXA．10，OXA．2编码基 因序列设计引物，由于CTXM系列酶之间同源性低，根据同源性关系， 按 C皿－M习，CD－M6和 CR－M习，CD－M七编码基因序列分别设计 4组引物，均由上海生工生物工程公司合成。用煮沸法提取产ESBLS 细菌质粒DNA，进行PCR扩增。扩增产物用0．8％琼脂糖凝胶电泳，以 Takara Marker 2000作为对照，溪乙锭染色后紫外灯下观察结果，初步判 断基因型。 1．6 PCR产物的纯化及序列分析 PCR扩增产物用Promega公司 的 Wzard PCR纯化试剂盒纯化，纯化后送上海生物技术有限公司用 he BI AISMR 377 DNA Sequencer测序。使用 DNAsist软件，将扩增 产物的基因序列与GENBANK中的已知序列对比分析，确定基因型。 2．实验结果 2．IESBLS的检出率 临床分离细菌共 198株，127株大肠埃希 菌和71 株肺炎克雷伯菌，产ESBLs菌株分离率分别为31．49％和 15．49％，总分离率为 25 76％。尿标本分离菌的 ESBLS检出率最高达 刀．58％，其它来源菌株的 ESBLs检出率依次为痰 20．34％，脓性分泌 物 20％和咽拭子 12．50％。 2．二 产ESBLs菌株对头抱唆厉、头抱他陡最低抑菌