目的:宫颈癌是在女性恶性肿瘤中发病率和死亡率排名第四位的疾病。近年来全球宫颈癌新发病例及死亡人数在不断增加,80%以上在发展中国家。虽然增加筛查的力度及扩大接种人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）疫苗的范围,可以减少宫颈癌的发生,但因经济及最佳接种年龄等问题,宫颈癌的发病率和死亡率仍在增高,特别是经济欠发达地区如非洲大陆以及中国的农村。即使随着早期诊断及疫苗研究的发展,宫颈癌的五年生存率有所提高,但复发及晚期转移仍然是临床治疗的难点。纳曲酮（Naltrexone,NTX）是一种非选择性阿片受体拮抗剂,能解除身体对阿片类药物的依赖,目前常被用来治疗阿片类药物成瘾及酒精依赖等,常用剂量50-100mg/d。研究者发现在低剂量时NTX有抑制肿瘤以及免疫调节的作用,称为低剂量纳曲酮（Low dose naltrexone,LDN）。据报道,LDN在多种肿瘤细胞系中均有抑制肿瘤生长的作用,但其机制并不完全明确。巨噬细胞（Macrophages）是天然免疫系统中非常重要的细胞,可以吞噬病原体、清除死亡细胞、外来微生物以及癌细胞。根据功能分为M1型巨噬细胞（经典激活巨噬细胞）与M2型巨噬细胞（替代活化巨噬细胞）。M1型分泌趋化因子以及IL-1、TNF-α、IL-6、IL-12等可以促进对病原体、肿瘤等的吞噬;M2型分泌IL-10、EGF、VEGF则促进肿瘤生长,降低M2型肿瘤相关巨噬细胞的活性,成为抗肿瘤治疗的手段之一。据报道在卵巢癌与乳腺癌中,LDN可通过与肿瘤细胞表面的阿片生长因子受体（opioid growth factor receptor,OGFr）结合,达到抑制肿瘤增殖的目的,但LDN在宫颈癌治疗中的作用,尚无相关报道。宫颈癌的远处转移一直是临床的治疗难点,LDN是否可以影响肿瘤细胞的上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）,本文将展开探讨。本实验将对LDN体内外抑制宫颈癌的作用及其潜在机制进行深入探讨,拟从以下三个方面进行研究:（1）体外LDN通过何种信号通路发挥抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移侵袭;（2）体内研究LDN对宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其信号通路,分析不同浓度LDN对肿瘤相关巨噬细胞及相关细胞因子的变化;（3）体外验证LDN是否通过OGFr发挥抑制肿瘤恶性生物学行为的作用,同时验证LDN能否通过OGFr抑制宫颈癌细胞EMT。研究方法:1、体外,Western blot法检测宫颈癌细胞系中OGFr的表达量,选取表达相对较高的细胞系完成后续实验（Hela、Siha细胞系）。采用CCK-8检测LDN对肿瘤的抑制作用,选用不同浓度（0、0.5、1.5、2、3、5mg/ml）的LDN作用宫颈癌细胞系,选出最佳作用剂量和最佳时间,完成后续的实验。采用最佳浓度和时间作用宫颈癌细胞系,通过克隆形成实验进一步检测LDN对宫颈癌Hela和Siha细胞系增殖能力的影响;流式细胞术来检测Hela和Siha细胞系的凋亡情况;细胞划痕实验和Transwell侵袭实验来检测Hela和Siha细胞迁移和侵袭的情况。qRT-PCR法检测VEGFR2、PI3K、PDK1、AKT、mTOR信号通路的mRNA表达变化,Western blot法检测VEGFR2、p-VEGFR2、PI3K、PDK1、AKT、p-AKT、mTOR的蛋白变化。2、体内,构建宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠腋下接种Hela细胞,随机分成四组,分为LDN给药组（0.5mg/kg/d,5mg/kg/d,10mg/kg/d）和对照组,观察裸鼠体重变化、测量瘤体积、称取瘤重。组间有明显差异后处死裸鼠,剥离皮下肿瘤,肿瘤组织行Western blot法检测不同剂量浓度的LDN对VEGFR2、p-VEGFR2、PI3K、PDK1、AKT、p-AKT、mTOR蛋白的表达水平的影响。将裸鼠瘤组织制成单细胞悬液,用免疫磁珠分选出CD45+细胞,应用流式细胞术分别检测各组免疫细胞中F4/80+CD11b+的比例,再从中检测标记CD86+的M1型巨噬细胞和标记CD206+的M2型巨噬细胞的比例。应用ELISA法检测裸鼠血液中的细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10及VEGF的表达水平。3、敲减验证,利用OGFr-siRNA有效序列包成慢病毒,用Western blot法筛选敲减效果最佳的慢病毒完成后续实验。将细胞分为四组Si-NC组、Si-NC+LDN组、Si-OGFr组、Si-OGFr+LDN组,体外细胞实验再次观察LDN对宫颈癌增殖、凋亡、迁移侵袭的抑制作用。用Western blot法检测各组之间E-Cadherin、N-Cadherin、Snail、Vimentin的表达水平差异。结果:1、体外,4种宫颈癌细胞系均存在OGFr的表达,选取表达相对较高的Hela和Siha细胞系完成后续实验。CCk-8实验提示LDN可显著抑制Hela和Siha宫颈癌细胞的增殖,并且存在着时间和浓度的依赖性。体外实验中LDN最佳浓度Hela细胞为1.26mg/ml,Siha细胞为1.83 mg/ml,最佳作用时间为48h。LDN可以抑制宫颈癌细胞克隆形成,诱导细胞凋亡,抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。LDN可以抑制VEGFR2、p-VEGFR2、PI3K、PDK1、AKT、p-AKT、mTOR蛋白的表达。2、LDN抑制宫颈癌Hela细胞裸鼠皮下移植瘤的增殖。在经过LDN治疗后随药物浓度的增加,裸鼠移植瘤生长更加缓慢,瘤体积明显减小,瘤重明显减轻,10mg/kg效果最佳,而不同LDN浓度与对照组之间裸鼠的体重无明显变化。LDN与对照组之间VEGFR2、p-VEGFR2、PI3K、PDK1、AKT、p-AKT、mTOR蛋白的表达水平有差异性,10mg/kg LDN抑制该信号通路的作用最明显。体内外均证明LDN可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。LDN可以间接影响肿瘤相关巨噬细胞,降低M2型巨噬细胞的比例。随LDN浓度增大,裸鼠血液中的细胞因子TNF-α、IL-6分泌增多,IL-10分泌减少、VEGF变化不大。3、LDN上调宫颈癌细胞中OGFr的表达,敲减OGFr后,LDN对宫颈癌的抑制增殖、迁移侵袭及促进凋亡的作用明显减弱,说明LDN通过OGFr发挥抑制肿瘤恶性生物学行为的作用。根据细胞划痕和Transwell侵袭实验我们得知LDN可以抑制宫颈癌细胞的侵袭。通过Western blot实验提示LDN抑制N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达,促进了E-cadherin的蛋白表达。敲减OGFr后LDN对EMT相关蛋白的抑制作用明显减弱。因此OGFr参与了LDN抑制宫颈癌的EMT相关蛋白的表达。结论:1、体外,在适宜的剂量下LDN具有抑制宫颈癌增殖、迁移侵袭、促进凋亡的作用;通过敲减OGFr的表达,减弱了LDN对宫颈癌的抑制作用;LDN抑制了宫颈癌细胞EMT相关蛋白的表达,OGFr起重要作用。2、体内,LDN可以抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的增殖,有剂量依赖性;间接影响了肿瘤相关巨噬细胞,降低M2型巨噬细胞的比例;间接促进了促炎因子TNF-α、IL-6的分泌,抑制抗炎因子IL-10的分泌。3、体内外实验均证实LDN可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制宫颈癌细胞增殖。