17α-乙炔基雌二醇对黄颡鱼稚鱼性逆转的诱导作用及关键基因筛选

来源 :扬州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jack607
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鱼类的性别决定和分化受到遗传因素和环境因素的共同影响,环境中外源性类固醇激素往往可以彻底改变遗传因素决定的性别分化方向。本研究分别以粉碎的黄颡鱼饲料和卤虫作为激素载体,设置不同的EE2处理浓度,在稚鱼生长的不同时期对其进行处理,通过测定雌性率、性腺未发育个体占比以及成活率确定不同载体、不同生长时期和不同浓度处理对性别逆转的作用;并通过测定全雄黄颡鱼在处理后的增重率、特定生长率和肥满度以确定EE2(17α-乙炔基雌二醇)处理对雄性黄颡鱼稚鱼生长的影响;由此综合确定EE2处理黄颡鱼稚鱼性逆转的适宜载体、适宜处理浓度和适宜处理时期。以卤虫为载体使用浓度为200 μg/L的EE2连续处理9 dah全雄黄颡鱼40天,分别对处理0天、20天和40天的黄颡鱼性腺组织中的转录本进行转录组测序分析,并对处理0天、20天和40天时雄性黄颡鱼性腺中Cyp11b2、Cyp19a1a和Cyp17a的表达量通过荧光定量PCR检测,确定EE2诱导黄颡鱼稚鱼性逆转过程中可能的关键基因,为进一步研究黄颡鱼性别决定和性别维持的分子机制提供理论依据,为黄颡鱼的遗传育种提供理论和技术支持。结果如下:1.以饲料为载体的不同浓度EE2处理普通黄颡鱼稚鱼,各处理组与对照组之间雌性率均无显著差异。各组性腺未发育个体占比均较大并随着浓度的增大并呈现上升的趋势。对照组中成活率明显高于各处理组(P<0.05)。以卤虫为载体的不同浓度EE2处理普通黄颡鱼稚鱼,各处理组所得雌性率均在90%以上,与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。各组性腺未发育个体占比较小且无显著差异。对照组中成活率明显高于各处理组(P<0.05)。2.以卤虫为载体的不同浓度EE2处理全雄黄颡鱼稚鱼,各处理组的增重率和特定生长率与对照组之间均存在显著差异(P<0.05),随着处理浓度增大,各组增重率和特定生长率呈现下降的趋势。100 μg/L处理组和200 μg/L处理组之间的增重率和特定生长率无显著差异。各处理组肥满度之间均存在显著差异(P<0.05)。3.以卤虫为载体在黄颡鱼生长的不同时期采用EE2处理普通黄颡鱼稚鱼,除21 dah处理组,其他各处理组的雌性率均在90%以上。性腺未发育个体占较小且各组之间并无显著差异。除18 dah处理组外随着处理时期的推迟黄颡鱼成活率整体呈现下降的趋势。以卤虫为载体在黄颡鱼生长的不同时期采用EE2处理全雄黄颡鱼稚鱼,9 dah处理组的增重率除与12dah处理组无显著差异,与其他各处理组之间均有显著差异(P<0.05)。9dah处理组、12 dah处理组和15 dah处理组三者之间的特定生长率均无显著差异,与其他各处理组之间均有显著差异(P<0.05)。各组的增重率和特定生长率随着处理时期的推迟均呈现下降的趋势。各处理组肥满度之间均无显著差异。4.转录组数据经过滤、拼接组装后获得transcript 192851条,GC含量为45.06%,N50为 1882 bp;unigenes 79715 条,GC 含量为 44.12%,N50 为 1782 bp,组装质量较好。5.对79715个unigenes进行功能注释和分类,30785个unigenes在Nr注释成功,占全部unigenes的38.62%。通过GO注释将其分成了 3个大类50个生物功能,其中注释在膜的生物功能最多。翻译后修饰、蛋白反转、伴侣是在eggNOG注释中除未知以外功能组最大的一类;KEGG注释分析分为六大类40小类317个通路,代谢是六大类功能组中最大的一类。6.对转录本进行比对筛选,获得EE2处理20天和处理40天实验组和对照组的显著差异基因,EE2处理20天时实验组与对照组的差异基因为5328个,其中4513个基因上调,815个基因下调;EE2处理40时实验组与对照组的差异基因为3021个,其中2642个基因上调,379个基因下调;对这些基因进行KEGG富集分析,发现有大量基因集中在类固醇激素合成通路上。7.结合荧光定量PCR检测,对获得的显著差异基因进行分析,在EE2处理20天(性逆转过程中)时,Star(不显著)、3β-HSD7(不显著)、11β-HSD2(不显著)、Cyp19a1b(不显著)、Cyp11b2(不显著)、Foxl2(显著)和Cyp19a1a(显著)相对于对照组表达量上调,17β-HSD2(不显著)、Cyp17a1(不显著)和Cyp26b1(显著)相对于对照组表达量下调。在EE2处理40天(性逆转完成后)时,Star(不显著)、3β-HSD7(不显著)、Cyp11b2(不显著)、Foxl2(不显著)、Cyp26b1(不显著)、11β-HSD2(显著)、Cyp17a1(显著)、Cyp19a1b(显著)和Cyp19a1a(显著)相对于对照组表达量上调,17β-HSD2(不显著)相对于对照组表达量下调。综上所述,相比饲料,卤虫是EE2处理黄颡鱼稚鱼性逆转过程中的适宜载体,且EE2的适宜处理浓度为100 μg/L和200 μg/L之间,EE2处理的适宜处理时期为9 dah和12 dah之间。在EE2处理20天时(性逆转过程中),性腺中卵巢形成标志性基因Foxl2、卵巢芳香化酶基因Cyp19a1a显著上调,RA降解酶Cyp26b1表达量显著下调,它们可能是EE2诱导黄颡鱼稚鱼性逆转的过程中的关键调控基因。
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