论文部分内容阅读
蛋白多肽类药物由于其特异性强、免疫原性低、毒副作用小且疗效显著的特点日益受到人们的重视。但由于蛋白多肽类药物通常分子量较大,结构复杂,体内浓度低且存在严重的内源性干扰,导致其体内定量非常困难。因此迫切需要开发操作简单、成本低廉且高通量的分析技术来加快生物药物的开发进程。目前最具开发前景的定量分析方法当属LC-MS/MS法,其中间接LC-MS/MS法适用范围广,然而复杂的样品处理和高昂的开发成本严重限制了其高通量应用,因此本研究尝试开发直接LC-MS/MS法用于多肽蛋白类药物的定量研究。本研究选择了APi1633(1254.6 Da)、利拉鲁肽(3751 Da)、重组人胰岛素(5807.7 Da)和EHL蛋白(16306 Da)为研究对象,开发了四种LC-MS/MS方法分别用于以上四种多肽蛋白药物的定量分析,并且应用所建立的方法开展了相应的药代动力学研究。首先,开发了用于APi1633定量的LC-MS/MS分析方法,该方法灵敏度良好,线性范围为2.5~2500 ng/mL,准确度在94.8%~101%之间。大鼠皮下给予APi1633后生物利用度达到97.0%。其次,建立了利拉鲁肽的LC-MS/MS定量分析方法,线性范围为0.5~250 ng/mL,准确度和精密度符合要求,回收率为80%~90%。大鼠皮下给予利拉鲁肽后生物利用度为11.4%。用于胰岛素定量的LC-MS/MS分析方法操作简单、定量准确,最低定量下限为38.46 pg/mL。LCMS/MS方法与RIA方法的对比性研究结果显示,本研究所建立的LC-MS/MS方法准确度更高。最后,建立了EHL蛋白定量的LC-MS/MS分析方法,首次实现了对完整生物大分子(分子量大于10000 Da)的直接LC-MS/MS法定量分析,线性范围为5~500 ng/mL,准确度在90.0%~101%之间,精密度符合要求,回收率约为25%。本研究成功建立了四种直接LC-MS/MS方法分别用于APi1633、利拉鲁肽、重组人胰岛素和EHL蛋白的定量研究,并且通过上述研究首次总结出适用于完整多肽、蛋白类药物(分子量小于20000 Da)直接LC-MS/MS定量分析的方法思路和研究策略。该研究成果促进了LC-MS/MS方法在多肽蛋白类药物定量中的应用,并为加快生物药的研发进程提供了良好的分析平台。同时该研究也是对现有理论的一种验证和突破,可为类似药物的药代动力学研究提供参考和方法支持。