背景和目的:抑郁症（Depression）是一种慢性,反复发作的精神疾病,其特征包括情绪低落、疲劳、虚弱、失眠、愉悦感丧失,自杀倾向等。重度抑郁症（Major Depressive Disorder,MDD）以高发病率和死亡率影响着世界范围内的众多人口,给患者的工作生活和身心健康带来极大的负面影响。全球有超过1.5亿人患有重度抑郁症,大约有8%的重度抑郁症患者最终死于自杀,给社会带来了极大的负担。根据世界卫生组织的分析,预计到2030年,抑郁症可能成为导致残疾和死亡的第二大主要原因。尽管已经对MDD的神经生物学进行了数十年的深入研究,但抑郁症神经病理学的确切机制仍未被完全了解。单胺假说被认为是一种精确的调控机制,并且在抑郁症的病因学中起着关键作用。基于单胺假说,MDD患者大脑内单胺类神经递质如5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素水平失衡。其他可能的病因包括谷氨酸受体改变、神经炎症、神经元细胞死亡、胶质细胞数量（星形胶质细胞）减少、下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）激活、神经发生减少和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）减少等因素,以及应激事件、遗传因素、表观遗传修饰等。基于单胺假说,已经开发出许多用于治疗抑郁症的药物,例如单胺氧化酶抑制剂（MAOIS）,选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIS）和三环抗抑郁药（TCAS）等,以减少这些单胺递质的降解。然而,最近的报道表明,只有三分之一的抑郁症患者在使用现有抗抑郁药物后,治疗效果得到完全改善,并且仅在治疗几周后才具有疗效。因此,目前迫切需要发现新型有效的抗抑郁药。星形胶质细胞是中枢神经系统最丰富的神经胶质细胞,具有多种的生理作用,如分泌神经营养物质、保护神经元、调节神经信号等,在中枢神经系统中扮演着极其重要的角色。星形胶质细胞合成并分泌许多神经营养因子,如BDNF,这些神经营养因子在神经元生存方面发挥重要作用。在哺乳动物,星形胶质细胞通过钠依赖性的高亲和系统摄取5-HT,星形胶质细胞表达不同的5-HT受体亚型,包括5-HT1A和5-HT2A,尤其是5-HT1A受体激活是SSRIs在富含胶质细胞的海马发挥作用的关键机制。目前,已有多项研究表明,星形胶质细胞参与了抑郁症的病理调节。在抑郁症患者的尸检标本免疫组化结果中发现MDD患者的背外侧前额叶皮层、眶额叶皮层、亚属皮层、前扣带回皮层和杏仁核中的星形胶质细胞的密度和数量均减少。同时,在MDD患者的额叶边缘皮质区、海马、灰质以及丘脑等区域中的星形胶质细胞的标志蛋白GFAP的表达也下降。而临床前研究也发现在具有抑郁行为的动物中,前额叶皮层和海马中的星形胶质细胞密度显著降低。以上研究提示抑郁症患者的脑组织皮质边缘回路区域的星形胶质细胞减少可能与其抑郁行为密切相关。星形胶质细胞的功能异常会导致谷氨酸循环和摄取减少,并导致谷氨酸积累,进而导致BDNF减少和海马神经发生减少。多项研究表明,目前临床上使用的抗抑郁症药物（例如氟西汀、利鲁唑和西酞普兰）亦能减少慢性轻度刺激诱导的星形胶质细胞减少。因此,星形胶质细胞是治疗抑郁症的一个重要的干预目标和治疗靶点。2005年哈佛大学袁均英教授团队首次发现程序性坏死（programmednecrosis）或坏死性凋亡（necroptosis）,它是一种可调控的、不依赖于半胱氨酸蛋白酶的细胞死亡途径,在形态学特征和信号通路上均有别于细胞凋亡,其在缺血性中风、神经退行性疾病、类风湿性关节炎和癌症等人类疾病中扮演着重要的角色。程序性坏死发生时,RIP 1K（receptor interacting protein 1 kinase）与 RIP3K（receptor interacting protein 3 kinase）通过各自的 RHIM（homotypic interaction motif）结构域相互结合,使 RIP3K发生自磷酸化,募集 MLKL（mixed lineage kinase like protein）并使 MLKL 磷酸化,磷酸化的MLKL与磷脂酰肌醇脂和心磷脂结合形成低聚物,此特性使MLKL从胞质移至质膜和细胞内膜,从而直接破坏膜的完整性,导致细胞坏死。程序性坏死通路激活时,程序性坏死通路相关的蛋白RIP1K、RIP3K、MLKL表达及其磷酸化增加,程序性坏死信号通路被激活。另外,研究表明:RIP1K/RIP3K/MLKL激活介导细胞发生程序性坏死,并释放炎症因子,引起神经炎症性损伤。近期,有研究报道三氯化铝可通过IL-1β/JNK信号通路引起大鼠海马神经细胞的程序性坏死和随后的抑郁样行为。然而,这项研究并未阐述程序性坏死发生在抑郁症大鼠的海马神经元还是星形胶质细胞中。因此,目前尚不清楚RIP1K/RIP3K/MLKL诱导的程序性坏死是否参与MDD相关脑区中星形胶质细胞的损伤。因此,本研究的科学假说之一是:RIP1K/RIP3K/MLKL诱导的程序性坏死在抑郁症相关脑区,如海马星形胶质细胞中激活,并引起星形胶质细胞发生程序性坏死,从而导致星形胶质细胞数量减少,其功能下降,并释放神经炎症因子,参与抑郁症的分子病理分子机制。目前,选择性5-羟色胺再摄取抑制剂与其他种类的抗抑郁药相比具有更加优越的安全性和耐受性,是抑郁症的一线治疗药物。氟西汀是第一个被FDA批准的5-羟色胺再摄取抑制剂,主要用于治疗抑郁症、强迫症、惊恐症、贪食症、暴饮暴食症、经前烦躁不安和躁郁症等。越来越多的证据表明,免疫失调和炎症可能在抑郁症中发挥重要的作用。已有研究报道,氟西汀除了作用于单胺能神经传递系统外,还具有神经保护和抗炎作用。但氟西汀的作用机制尚未完全挖掘。新近文献报道,氟西汀的抗抑郁作用与其通过激活自噬减轻星形胶质细胞损伤有关。那么,氟西汀是否通过抑制星形胶质细胞程序性坏死激酶（如RIP1K、RIP3K和MLKL）激活,从而抑制星形胶质细胞发生程序性坏死,而发挥抗抑郁作用呢?这是本文要解决的另一个重要问题。因此,我们提出第二个假说,即氟西汀可能通过抑制RIP1K/RIP3K/MLKL激活诱导的星形胶质细胞的程序性坏死,保护抑郁症诱导的星形胶质细胞损伤,促进星形胶质细胞功能及抑制其介导的炎症反应,从而发挥抗抑郁作用。本文建立了小鼠慢性不可预测轻度应激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）模型及体外皮质酮（Corticosterone,Cort）诱导的人星形胶质细胞损伤,以证明以上两个科学假说。方法:1.体内实验方法在体内,以9种不同的压力源刺激雄性C57BL/6J小鼠5周,建立慢性不可预测轻度应激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）抑郁症动物模型。采用 CUMS分别处理小鼠1,3,5周,以观察CUMS刺激不同时间点,小鼠的抑郁样行为、体重的变化;小鼠海马组织中星形胶质细胞的数量及功能的变化;以及星形胶质细胞程序性坏死激酶和炎症因子的变化。小鼠接受不同压力源刺激的同时,以每天10 mg/kg的剂量腹腔注射氟西汀（Fluoxetine,FLX）5周,通过检测小鼠的抑郁样行为,以评估FLX的抗抑郁作用;并观察FLX对CUMS小鼠海马组织中星形胶质细胞的数量及功能（检测BDNF和5-HT1A）变化的影响;以及其对星形胶质细胞程序性坏死激酶（RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K 和 MLKL/p-MLKL）和炎症因 子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6）变化的影响。小鼠的抑郁样行为通过矿场实验（Open field test,OFT）、蔗糖偏爱实验（Sucrose preference test,SPT）、强迫游泳试验（Force swimming test,FST）和尾部悬吊试验（Tail suspension test,TST）来评估。通过石蜡切片方法观察小鼠海马中星形胶质细胞数量的变化。通过免疫组织化学双染色法观察小鼠海马中星形胶质细胞标记蛋白GFAP阳性细胞中坏死性凋亡激酶（RIP1K和RIP3K）、脑源性神经营养因子（BDNF）及5-HT1A的表达情况。通过Western Blotting方法观察小鼠海马中GFAP、BDNF、5-HT1A、以及 RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K 和MLKL/p-MLKL 的表达情况。通过 ELISA 方法检测小鼠海马中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。2.体外细胞实验方法在体外,培养人的星形胶质细胞（human astrocyte,HA）,以200 μM皮质酮（corticosterone,Cort）处理人的星形胶质细胞诱导损伤模型。Cort诱导人星形胶质细胞损伤,使用RIP1K特异性抑制剂Necrostatin-1（Nec-1,100μM）、RIP3K的特异性抑制剂 GSK872（10 μM）和 MLKL 的特异性抑制剂 Necrosulfonamide（NSA,1μM）,观察以上3种坏死性凋亡抑制剂对Cort诱导星形胶质细胞程序性坏死激酶激活、程序性坏死、BDNF、5-HT1A和炎症因子的变化的影响。用Cort处理人的星形胶质细胞的同时,给予1 μM氟西汀,以评估氟西汀对星形胶质细胞的保护作用,及其对Cort诱导星形胶质细胞程序性坏死激酶激活、程序性坏死、BDNF、5-HT1A和炎症因子的变化的影响。Cort诱导人星形胶质细胞损伤,使用氟西汀与RIP1K特异性抑制剂Nec-1,或RIP3K的特异性抑制剂GSK-872,或MLKL的特异性抑制剂NSA合用,观察氟西汀分别与以上3种抑制剂合用是否能协同保护星形胶质细胞损伤。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒检测Cort和氟西汀处理人星形胶质细胞后,其活力的变化。通过碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）法检测3种坏死性凋亡抑制剂或氟西汀对Cort诱导的人星形胶质细胞程序性坏死的影响。通过Western blotting 法检测人的星形胶质细胞中 GFAP、BDNF、5-HT1A、RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K和MLKL/p-MLKL的蛋白表达水平。用ELISA方法检测人星形胶质细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。结果:1.程序性坏死激酶参与抑郁症模型诱导的星形胶质细胞减少,介导星形胶质细胞坏死性凋亡及炎症因子释放1.1 CUMS诱发呈时间依赖性的小鼠体重减轻和抑郁样行为采用CUMS分别刺激C57BL/6小鼠1周、3周或5周,称量小鼠体重,并通过SPT和OFT检测小鼠的抑郁样行为。实验结果显示,CUMS刺激小鼠1周后,CUMS组小鼠的体重未发生明显变化,而在CUMS刺激3周和5周后,CUMS组小鼠的体重相较于对照组显著减少。同时,SPT与OFT检测结果显示,CUMS刺激1周时,CUMS组小鼠的蔗糖摄入量和运动速度未发生明显变化,而在CUMS刺激3周后,CUMS组小鼠的蔗糖摄入量和运动速度均出现显著下降,且这种下降在CUMS刺激5周后进一步加重。以上结果提示:CUMS刺激3周后,小鼠开始出现体重下降和抑郁样行为,且随着CUMS刺激时间的增加,其抑郁样行为逐渐加重。1.2 CUMS呈时间依赖性诱导小鼠海马中星形胶质细胞和BDNF水平减少,程序性坏死激酶激活以及炎症因子上调Western blotting和免疫组化结果显示,CUMS刺激小鼠1周后,小鼠海马区的星形胶质细胞数量和GFAP水平未发生显著变化,而CUMS刺激小鼠3周后,小鼠海马区的星形胶质细胞数量和GFAP水平开始减少,且CUMS刺激小鼠5周后,这种减少进一步加剧。同样地,小鼠海马GFAP阳性星形胶质细胞中BDNF水平在CUMS刺激1周后未发生明显变化,在CUMS刺激3周后显著减少,并且这种减少在CUMS刺激5周时进一步加剧。CUMS诱导的星形胶质细胞的数量减少和功能失常是否与程序性坏死的激活相关?我们进一步检测了程序性坏死激酶RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K和MLKL/p-MLKL在CUMS处理的小鼠海马中的表达情况。Western blotting结果和免疫组化显示,在CUMS刺激1周时,这些程序性坏死激酶未发生明显变化,而在CUMS刺激3周后,小鼠海马组织中RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K和MLKL/p-MLKL水平增高并磷酸化激活,且GFAP 阳性星形胶质细胞中程序性坏死激酶RIP1K、RIP3K水平增高,并且这些变化在CUMS刺激5周后进一步加重。这些结果表明CUMS呈时间依赖性诱导的小鼠海马星形胶质细胞中程序性坏死通路激活。炎症反应在抑郁症的发病进程中有着极其重要的作用,而程序性坏死通路的激活亦能诱发炎症反应进一步加重。因此,本文采用ELISA方法,检测了小鼠海马组织炎症因子变化。结果同样发现,CUMS也呈时间依赖性诱导小鼠海马中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平增加。在CUMS刺激一周时,这些炎症因子并未出现显著变化,而小鼠海马中的炎症因子水平在CUMS刺激3周后显著升高,并且在CUMS诱导5周后进一步升高。以上结果表明,与CUMS呈时间依赖性诱导小鼠抑郁样行为一致,CUMS亦呈时间依赖性减少小鼠海马星形胶质细胞数量,降低BDNF水平,激活程序性坏死激酶,释放炎症因子。1.3程序性坏死激酶抑制剂能够抑制Cort诱导的人星形胶质细胞程序性坏死激酶激活,逆转星形胶质细胞的减少,恢复星形胶质细胞功能并抑制炎症因子的释放。在抑郁症发生后,脑组织中皮质醇含量升高,导致神经细胞损伤,因此,本文通过Cort诱导人星形胶质细胞损伤来建立体外抑郁症星形胶质细胞损伤模型。在使用不同浓度的Cort诱导人星形胶质细胞损伤后,通过Western blotting检测星形胶质细胞GFAP水平。Western blotting结果显示随着Cort的浓度增加,Cort诱导的GFAP水平减少进一步加剧,200μM Cort诱导的人星形胶质细胞的GFAP水平下降最为显著。因此我们选择200μM Cort在体外模拟抑郁症诱导的星形胶质细胞损伤,并使用RIP1K抑制剂Nec-1、RIP3K抑制剂GSK872和MLKL抑制剂NSA进一步验证程序性坏死在抑郁症诱导的星形胶质细胞损伤中的作用。Western blotting结果进一步显示,Cort能够显著诱导人星形胶质细胞中RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K和MLKL/p-MLKL 的表达升高,并激活 RIP1K、RIP3K 和 MLKL（表现为 RIP1K、RIP3K和MLKL的磷酸化水平升高）,而程序性坏死激酶抑制剂Nec-1、GSK872和NSA能够分别下调Cort诱导的人星形胶质细胞中RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K和MLKL/p-MLKL的表达,抑制其激活。同时碘化丙啶（PI）染色结果显示,Cort诱导的人星形胶质细胞PI阳性细胞百分率相比对照组显著增加,而经Nec-1、GSK872和NSA处理后,PI阳性细胞百分率显著减少,这表明程序性坏死抑制剂能够通过抑制程序性坏死相关激酶减少Cort诱导的星形胶质细胞程序性坏死。此外,Western blotting结果还显示,Cort能够显著下调BDNF和5-HT1A的表达,而Nec-1、GSK872和NSA则能够逆转由Cort导致BDNF和5-HT1A水平降低。这提示我们程序性坏死抑制剂能够恢复星形胶质细胞功能。此外,ELISA结果显示,Nec-1、GSK872和NSA均能够显著减少Cort诱导的人星形胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放。以上结果显示,程序性坏死抑制剂能够通过抑制Cort诱导的人星形胶质细胞程序性坏死激酶激活,从而逆转Cort诱导的星形胶质细胞减少,恢复星形胶质细胞功能,减少炎症因子的释放,以保护星形胶质细胞。2.氟西汀能够改善CUMS介导的小鼠抑郁样行为,抑制抑郁症模型诱导的星形胶质细胞减少、星形胶质细胞程序性坏死和功能障碍,减少炎症因子的释放2.1氟西汀能够改善CUMS介导的小鼠抑郁样行为以CUMS处理小鼠5周,结果显示CUMS处理小鼠2周后其体重显著降低,4周后其SPT蔗糖摄入量显著降低,OFT运动速度显著降低,表明抑郁症造模已经成功。而氟西汀治疗后,第4周和第5周CUMS小鼠的体重显著增加,SPT蔗糖消耗百分比也显著升高。在OFT测试中,氟西汀治疗4周后小鼠自发运动能力无明显变化,但5周后氟西汀治疗小鼠的速度明显提高。同时,氟西汀治疗5周显著减少FST和TST测试中CUMS抑郁小鼠的不动性时间。以上结果说明,氟西汀能改善CUMS诱导的小鼠抑郁样行为。2.2氟西汀抑制CUMS或Cort诱导的程序性坏死激酶激活,逆转GFAP的减少,抑制星形胶质细胞坏死在CUMS处理5周后的小鼠海马中,程序性坏死相关激酶RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K和MLKL/p-MLKL的表达显着增加,而氟西汀治疗可显著抑制CUMS小鼠海马中程序性坏死激酶的表达。免疫组化结果也显示,在CUMS小鼠海马中GFAP 阳性星形胶质细胞中,程序性坏死相关激酶RIP1K和RIP3K表达升高,而氟西汀治疗可显著抑制其表达。体外实验亦得到相似结果,Western blotting结果表明,在 Cort 处理的人星形胶质细胞中,RIP1K/p-RIP1K、RIP3K/p-RIP3K 和 MLKL/p-MLKL的表达也增加,而氟西汀可以抑制程序性坏死激酶的表达。。以CUMS处理小鼠5周后,Western blotting结果显示CUMS处理的小鼠海马中的GFAP蛋白表达显著减少,而氟西汀治疗可以增加CUMS小鼠海马中GFAP蛋白的表达。免疫组化结果显示,CUMS小鼠海马中GFAP阳性细胞的数量显着减少,而氟西汀治疗显著增加星形胶质细胞的数量。体外实验亦得到相似结果,在Cort诱导人星形胶质细胞的体外抑郁模型中,Western blotting结果显示Cort处理的人星形胶质细胞中的GFAP蛋白表达显着减少,而氟西汀治疗可以增加GFAP的表达。CCK8结果显示,Cort处理的人星形胶质细胞的细胞活力显著降低,而氟西汀治疗显著增加了细胞活力。碘化丙啶（PI）染色显示,Cort处理组的PI阳性细胞数与对照组相比显著增加,而氟西汀能减少Cort诱导的人星形胶质细胞的坏死。2.3氟西汀阻止CUMS或Cort诱导的海马或人星形胶质细胞BDNF和5-HT1A蛋白水平的降低以CUMS处理小鼠5周后,Western blotting结果显示,CUMS小鼠海马区5-HT1A和BDNF的表达水平明显降低,而氟西汀可以上调5-HT1A和BDNF的表达。同样,在Cort处理的人星形胶质细胞中,Western blotting结果显示,氟西汀可以逆转Cort诱导的5-HT1A和BDNF水平的降低。以上结果说明,氟西汀能逆转应激诱导的BDNF和5-HT1A蛋白水平的降低,改善了星形胶质细胞的功能。2.4氟西汀抑制CUMS或Cort诱导的海马或人星形胶质细胞炎症因子的释放ELISA分析结果显示,以CUMS处理小鼠5周后,小鼠海马中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平显著增高,而氟西汀能显著减少CUMS诱导的炎症因子的释放。同样,在Cort处理的人星形胶质细胞中,炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放也显著增多,而氟西汀可以显著减少这些炎症因子的释放。3.氟西汀与程序性坏死激酶抑制剂联合用药进一步减少Cort诱导的星形胶质细胞损伤基于以上结果,我们推测氟西汀与程序性坏死激酶抑制剂联合用药可能会有协同保护星形胶质细胞损伤。因此,本文以低剂量的氟西汀分别与低剂量的程序性坏死激酶抑制剂Nec-1、GSK872或NSA联合用药,加入Cort处理的人星形胶质细胞中,并以CCK-8测量其对细胞活力的影响。CCK-8检测结果显示,在Cort处理的人星形胶质细胞中,当低剂量的氟西汀、Nec-1、GSK872或NSA单独使用时,氟西汀对细胞活力没有显著提升,Nec-1、GSK872和NSA有较小的提升,而低剂量的氟西汀分别与低剂量的Nec-1、GSK872或NSA联合使用时,可以进一步提高Cort诱导人星形胶质细胞的细胞活力降低。以上结果说明氟西汀与程序性坏死激酶抑制剂联合用药在减少Cort诱导的星形胶质细胞的损伤过程中具有协同作用。结论:1.CUMS或Cort诱导星形胶质细胞程序性坏死激酶RIP1K/RIP3K/MLKL激活,介导星形胶质细胞发生程序性坏死,减少星形胶质细胞数量并降低其功能,并抑制其介导的炎症因子释放。2.程序性坏死激酶的特异性抑制剂Nec-1、GSK-872和NSA分别通过抑制RIP1K,RIP3K或MLKL激活,抑制星形胶质细胞程序性坏死,从而保护星形胶质细胞及减少其介导的炎症因子释放。3.氟西汀通过抑制星形胶质细胞RIP1K/RIP3K/MLKL激活,减少星形胶质细胞程序性坏死,从而保护星形胶质细胞及减少其介导的炎症因子释放,从而发挥抗抑郁症作用。4.氟西汀与程序性坏死激酶抑制剂合用,具有协同保护星形胶质细胞损伤的作用。总之,本研究发现了程序性坏死激酶RIP1K/RIP3K/MLKL激活介导程序性坏死在抑郁症诱导的脑中星形胶质细胞减少中发挥重要作用,并发现氟西汀抗抑郁作用的新机制,即抑制RIP1K/RIP3K/MLKL激活介导的星形胶质细胞程序性坏死。氟西汀是直接还是间接抑制RIP1K/RIP3K/MLKL激活,有待于进一步研究。本研究为抑郁症的治疗开辟了新的方向,亦为研究和开发与程序性坏死相关的抑郁症及其它神经退行性疾病的新药物提供科学依据。