甘肃省是我国重要的马铃薯种薯和商品薯生产基地,马铃薯产业已成为带动甘肃农业和农村经济发展、促进农业增效和提高农民收入的战略性主导产业。本研究针对甘肃中部半干旱地区马铃薯农田,通过在主产区多点采样,采用基于16S rRNA基因的高通量测序等分子生态学技术,研究了马铃薯土壤细菌群落结构特征和地理分异规律及其与土壤主要化学性质的关系。同时,依托甘肃省定西市安定区的马铃薯定位试验,采用实时荧光定量PCR、高通量测序和基于DNA的稳定性同位素核酸探针技术（DNA-based stable isotope probing,DNA-SIP）,以16S rRNA基因和氨氧化微生物amoA基因为分子标靶,大田试验和室内微宇宙培养实验相结合,研究连续不同施氮量及不同施肥管理对土壤细菌和氨氧化功能微生物及其活性的影响规律。主要研究结果如下:1地理位置和土壤主要化学性质共同影响了甘肃中部马铃薯产区农田细菌群落结构针对甘肃中部马铃薯主产区,选择了20个种植地块土壤,通过分析样地的地理位置（纬度、经度、海拔）以及土壤主要化学性质（有机质、全氮、含水量、pH、碳氮比）,发现地理位置和土壤主要化学性质共同影响了土壤的细菌群落结构。1.1甘肃中部马铃薯主产区土壤的主要化学性质（pH、有机质、全氮、含水量）呈纬度梯度分布的规律。其中,土壤pH与纬度正相关,有机质、全氮和含水量与纬度呈负相关;1.2高通量测序共检测到22个细菌门,其中优势门共有10个,分别是酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、浮霉菌门（Planctomycetes）、芽单孢菌门（Gemmatimonadetes）、放线菌门（Actinobacteria）、硝化螺菌门（Nitrospirae）、装甲菌门（Armatimonadetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是土壤中起主导作用的细菌门,这些门的序列数占总序列数的比例达到96.3%。酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度与土壤有机质、全氮和含水量均呈正相关关系,放线菌门（Actinobacteria）、芽孢单菌门（Gemmatimonadetes）和装甲菌门（Armatimonadetes）相对丰度则分别与有机质、全氮和含水量呈负相关。在细菌目分类水平,Acidobacteria Subgroup 4、Sphingobacterials、Xanthomonadales均与土壤有机质、全氮和含水量呈显著正相关,而Gemmatimonadales、Cytophagales、Planctomycetales则与土壤有机质、全氮和含水量显著呈负相关。在属水平,Blastocatella与土壤有机质、全氮和含水量呈显著正相关;1.3在微生物操作分类单元（operational taxonomic unit,OTU）水平,地理位置可能是群落结构分异的重要驱动力。土壤细菌系统发育丰度和系统发育多样性与地理位置显著相关,其中,系统发育丰度和系统发育多样性均与经度呈显著负相关,而与海拔呈显著正相关关系;1.4地理位置和主要土壤主要化学性质共同决定了土壤细菌群落的分异,并且土壤主要化学性质对细菌群落结构变化的影响强于地理位置对其的影响。非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling,NMDS）表明,土壤主要化学性质（土壤有机质、全氮、含水量）与NMDS1和NMDS2分别呈显著正相关和显著负相关,而地理位置仅和NMDS1呈显著正相关关系。冗余分析（redundancy analysis,RDA）也表明,有机质含量、全氮、纬度、海拔和经度均是影响区域范围内细菌群落结构的重要环境因子。地理位置共解释了14.2%的细菌群落变异,而土壤主要化学性质可解释31.4%的细菌群落变异。本研究条件下,土壤有机质、全氮和含水量是影响细菌群落结构发生变化的最重要土壤环境因素;1.5采样农田马铃薯产量在6.0 t ha^-169.8 t ha^-1之间,最高和最低产量差达到11.6倍。本试验条件下,相对于低产农田,高产农田土壤中具有促进有机质降解功能的绿弯菌门、Anaerolineales目以及具有耐旱特性的厚壁菌门类细菌群落相对丰度相对较高。2连续不同施氮量显著改变马铃薯根区土壤细菌和氨氧化微生物的群落结构连续不同施氮量定位试验开始于2013年,设置六个施氮量处理:（1）N0:对照,不施肥;（2）N75:75 kg N ha^-1;（3）N150:150 kg N ha^-1;（4）N225:225 kg N ha^-1;（5）N300:300 kg N ha^-1;（6）N375:375 kg N ha^-1。采用高通量测序、实时荧光定量PCR等分子生态学技术,分析了2016年块茎膨大期（连续3年施氮）0²0 cm和20⁴0 cm土壤细菌和氨氧化微生物群落,连续不同施氮量显著影响了根区土壤细菌和氨氧化微生物群落结构。2.1连续不同施氮量改变了根区土壤细菌群落结构,硝态氮含量和pH是细菌群落结构发生变化的主要环境因子。变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门是本试验根区土壤中的优势细菌门。细菌数量随着施氮量的增加而增加,至N225土壤达到最大,过量施氮细菌数量出现降低。土壤硝态氮含量和pH分别解释了16.9%和16.0%的细菌群落差异。连续不同施氮显著提高拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度,N375土壤较N0分别增加32.0%（0²0cm）和46.1%（20⁴0 cm）;2.2连续不同施氮量条件下氨氧化功能微生物群落发生了明显分异。根区土壤氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria,AOB）和氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea,AOA）的丰度对连续不同施氮量的响应不同,AOB的相对丰度则随着施氮量的增加而显著增加,N375土壤AOB相对丰度在0²0 cm和20⁴0 cm土壤分别是N0的11.9倍和3.7倍,而AOA相对丰度并未受到连续不同氮量用量的影响,表明AOB主导了根区土壤氨氧化过程。实时荧光定量PCR的结果也表明,根区土壤AOB的数量随氮肥施用量的增加而显著增加,两个土层amoA基因拷贝数分别是N0的11.8倍和7.8倍。AOB对连续不同氮素用量的响应更为敏感,主导了根区土壤的硝化作用;2.3利用高通量测序技术分析AOB和AOA的系统发育进化关系。结果表明,长期不施肥对照根区土壤中,Nitrosospira Cluster 3类分支主导了AOB,而54d9类分支主导了AOA群落结构。长期氮肥施用改变了AOB和AOA群落结构,施氮导致29i4类分支被刺激,N375土壤29i4类分支取代54d9类分支,成为0²0 cm土壤的主导AOA分支。2.4连续不同施氮量显著提高了土壤中硝态氮含量,并且土壤硝化潜势显著增加。N375土壤硝化潜势显著高于低氮（N75、N150）和中氮（N225）土壤,0²0 cm和20⁴0 cm土壤分别是N0的2.0倍和2.8倍,而硝态氮含量在0²0 cm和20⁴0 cm土壤分别是N0的13.7倍和17.6倍;2.5马铃薯产量受连续不同施氮量的影响。马铃薯产量以N75处理最高,较N0增产15.1%,N150、N225、N300、N375处理马铃薯产量较N0分别降低4.1%、6.0%、1.9%和10.8%,过量施氮马铃薯产量下降。本试验条件下,相对于低产土壤,高产土壤中具有潜在致病的拟杆菌门类和链霉菌属类细菌群落相对丰度相对较低。3不同施肥管理影响了根区土壤细菌及氨氧化微生物群落结构不同施肥管理定位试验开始于2015年,设置四个不同施肥处理:（1）CK:对照,不施肥;（2）NPK:单施化肥;（3）M:单施有机肥;（4）NPKM:化肥有机肥配施。采用高通量测序、定量PCR的方法分析2016年10月（连续2年施肥,马铃薯收获期）0²0 cm和20⁴0 cm土壤样品细菌和氨氧化微生物群落结构,我们发现土壤细菌和氨氧化微生物群落结构受到不同施肥管理的影响。3.1不同施肥管理改变了根区土壤细菌群落结构。变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和装甲菌门是本试验根区土壤中的优势细菌门。施肥显著提高了根区土壤细菌数量,M处理细菌数量在0²0 cm和20⁴0 cm土壤较CK分别高出40.9%和50.0%。根区土壤pH解释了30.2%的细菌群落差异,使短期不同施肥管理根区土壤细菌群落结构发生变异的主导环境因子。不同施肥管理使变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、装甲菌门和绿弯菌门平均相对丰度增加,平均相对丰度相较CK土壤分别增加10.4%、7.9%、7.9%、3.2%、2.1%和0.5%。3.2根区土壤AOA和AOB群落对不同施肥管理的响应不同,AOB主导了根区土壤氨氧化过程。M和NPKM处理根区土壤AOA相对丰度较CK在0²0 cm和20⁴0cm土壤分别显著降低9.0%和9.3%,以及5.2%和4.4%（P<0.05）。而化肥（NPK）和有机肥（M、NPKM）的施入均能够增加根区土壤AOB的数量。表明在本研究条件下,AOB对肥料的响应能力要高于AOA,主导了不同施肥管理下的根区土壤的氨氧化过程;3.3不同施肥管理改变了根区土壤氨氧化微生物群落结构。M和NPKM处理中29i4类AOA相对丰度高于CK和NPK土壤,而Nitrososphaera viennensis类AOA分支尽管不是根区土壤主导AOA分支,但其相对丰度在NPK土壤中达到最大,表明该分支更易受到土壤氮素含量的影响;3.4单施化肥（NPK）较有机肥添加处理（M、NPKM）显著提高了土壤硝态氮含量。NPK处理0²0 cm和20⁴0 cm土壤硝态氮含量分别较CK高出46.9%和73.8%;3.5马铃薯块茎产量受不同施肥的影响。NPK、M、NPKM处理马铃薯块茎产量分别较CK增加0.3%、14.9%和7.0%,其中M处理马铃薯块茎产量增加显著（P<0.05）。在本研究条件下,相较于低产土壤,高产土壤中具有促进有机质降解功能的Steroidobacter类细菌群落相对丰度相对较高。4 DNA-SIP技术发现连续不同施氮量导致土壤活性氨氧化功能微生物多样性降低针对上述定位试验,于2015年8月（连续施氮第3年,马铃薯块茎膨大期）采集CK（不施氮）、LN(低氮,75 kg N ha^-1)和HN(高氮,375 kg N ha^-1)三个处理马铃薯土壤样品,利用稳定性同位素¹³C示踪马铃薯土壤中氨氧化功能微生物的核酸DNA,通过克隆文库和实时荧光定量PCR等分子方法,设置三个稳定性同位素示踪的微宇宙培养实验,包括:（1）¹²CO₂对照;（2）¹³CO₂标记和（3）¹³CO₂+C₂H₂,对马铃薯土壤的活性硝化微生物群落进行了研究,探究AOA及AOB对马铃薯土壤硝化作用的相对贡献。4.1连续不同施氮量显著增加了¹³C标记土壤活性AOA和AOB数量。HN土壤¹³C标记活性AOA和AOB amoA基因拷贝数分别为2.58×10⁴ copies和1.55×10⁶ copies,分别较CK增加1.6倍和16.2倍,活性细胞数分别为CK的2.4倍和24.0倍,在本研究中,是AOB主导了土壤氨氧化过程;4.2土壤主导¹³C活性AOA和AOB在连续不同施氮量下条件下发生了改变。活性AOA 54d9类分支在HN土壤比例达到90%,而Nitrososphaera gargensis类分支和Nitrososphaera viennensis类分支活性受到抑制并在那HN土壤中消失。同时,连续不同施氮量也导致HN土壤主导活性AOB分支由Nitrosospira briensis类分支转为Nitrosospira sp.TCH711类分支。