肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,在我国呈逐年上升趋势,其中80%以上的肺癌为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC).因传统化疗药物对NSCLC效果有限,而分子靶向治疗为NSCLC的治疗带来希望。吉非替尼(gefitinib,Gef)是NSCLC治疗中的第一个靶向药物,具有特异性强,耐受性好,不良反应少的特点。然而,获得性耐药是临床Gef治疗失败的主要原因。白藜芦醇(Resveratrol,Res)为天然多酚类化合物,研究表明Res在肿瘤的发生、促进和发展三个阶段都具有抗肿瘤作用,Res可通过一种或多种途径增强其他抗肿瘤药物的活性,具有良好的应用前景。本研究旨在探讨Res减缓非小细胞肺癌Gef耐药的作用及其机制。为解决NSCLC治疗中Gef耐药问题提供新的思路,为Res的新药研发及临床应用提供实验依据。本研究分以下三个部分：第一部分白藜芦醇联合吉非替尼对PC9/G细胞增殖的影响目的：构建对吉非替尼(gefitinib,Gef)耐药的非小细胞肺癌PC9/G细胞株；初步探讨Gef,白藜芦醇(resveratrol,Res)单用或两药以不同方式合用对PC9/G细胞的增殖抑制作用,并筛选两药合用的最佳方式。方法：选择对Gef敏感的PC9细胞,使用含梯度浓度Gef(0.01-1.0μM)的培养基持续培养3个月,诱导其耐药。经细胞单克隆筛选出耐药倍数较高的PC9/G细胞株,比较PC9与PC9/G细胞在形态特征和增殖特性等方面的差异。MTT法检测Gef、Res单用及两药按不同方式合用72h对PC9/G细胞的增殖抑制作用,采用联合指数(combination index,CI)比较并评价不同方式合用的作用效果。结果：耐药PC9/G细胞株与敏感PC9细胞株相比,细胞形态和增殖特性均发生了变化。PC9/G细胞对Gef的耐药倍数为PC9细胞的310倍,且生长系数增大(P<0.05),倍增时间缩短(p<0.05),分别为PC9细胞的2.0倍和0.7倍。Gef、Res对PC9/G的IC50值分别为6.54μM和33.9μM;Res与Gef同时联合给药具有显著协同作用(CI<0.9)。结论：体外成功构建PC9/G耐药细胞株；Res可显著增强Gef对PC9/G细胞的增殖抑制作用,且Res与Gef同时联合给药的协同效果最好。第二部分白藜芦醇对吉非替尼在PC9/G细胞内动力学和EGFR磷酸化的影响目的：探讨PC9和PC9/G细胞内Gef浓度变化与EGFR磷酸化的相关性,阐明Res对PC9/G细胞内Gef药物动力学及EGFR磷酸化的影响及机制。方法：建立高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)方法,检测细胞内Gef的勺药物浓度。Western blot检测EGF磷酸化水平以及药物转运体ABCG2、ABCB5和药物代谢酶CYP1A1、 CYP2D6的蛋白表达。运用回归算法分析PC9和PC9/G细胞内EGFR磷酸化抑制率与Gef浓度的相关性。结果：①建立测定细胞内Gef浓度的HIPLC-MS/MS方法,在1-1000nM范围内线性关系良好(R2>0.99)。②细胞外Gef浓度为1-20μM围内,与PC9细胞相比,PC9/G细胞内Gef的蓄积较少,对EGFR磷酸化的抑制较弱。PC9和PC9/G细胞内磷酸化EGFR抑制率与Gef的浓度呈线性相关(R2>0.89)。③Res可显著增加PC9/G细胞内Gef的AUC、Cmax,降低清除率CL。④PC9/G细胞内ABCG2、ABCB5和CYP1A1蛋白表达均升高,分别为PC9细胞的1.6倍、1.3倍和3.7倍(P<0.05,P<0.01),而CYP2D6蛋白表达无显著差异(P>0.05)。Res联合Gef组ABCG2和CYP1A1的蛋白表达显著降低,分别为对照组的33%和17%(p<0.01),而对ABCB5和CYP2D6无显著影响。结论：PC9和PC9/G细胞内EGFR磷酸化抑制程度与Gef的浓度相关。ABCG2、ABCB5和CYP1A1可能参与PC9/G细胞的耐药。Res可显著影响Gef在PC9/G细胞内的药物动力学过程,降低Gef在细胞内的转运和代谢速率。提示两药联合可通过减少细胞内Gef的代谢和外排来增加细胞内Gef的浓度,进而提高抑制EGFI磷酸化的程度,从而增强其药效。第三部分白藜芦醇联合吉非替尼对PC9/G细胞凋亡、自噬和衰老的影响目的：探讨Res联合Gef对PC9/G细胞凋亡、自噬和衰老的影响,阐明细胞凋亡、自噬和衰老在Res克服PC9/G细胞Ge耐药中的作用及三者之间的关联。方法：荧光显微镜观察DAPI染色标记细胞和单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine, MDC)染色标记细胞自噬体,流式细胞术检测细胞凋亡、自噬和细胞周期,p-半乳糖苷酶(Senescence-associated beta-galactosidase, SA-β-Gal)染色法检测细胞的衰老；Western blot检测p21, p53, LC3B, Beclin1及cleaved caspase-3的蛋白表达。结果：①与对照组比较,Res联合Gef组PC9/G细胞的凋亡率、自噬率及SA-β-Gal染色阳性率均显著升高(P<0.01)。与Gef单用组相比,Res联合Gef组PC9/G细胞的凋亡率、自噬率及SA-β-Gal染色阳性率均显著升高(P<0.01)。细胞周期检测结果表明,与对照组和Gef单用组相比,Res联合Gef组G2/M期细胞比例明显增加,G1期和S期细胞比例明显减少,差异有显著性意义(P<0.01)。②加入凋亡抑制剂AAc-DEVD-CHO(DEVD),对Res联合Gef抑制PC9/G细胞的增殖作用无显著影响(P>0.05)。加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methy ladenine,3-MA),可显著增强Res联合Gef对PC9/G细胞的增殖抑制作用(P<0.05)。DEVD抑制Res联合Gef诱导的细胞凋亡(P<0.05),对细胞自噬和衰老无明显影响(P>0.05)。3-MA显著抑制Res联合Gef诱导的细胞自噬(P<0.01),增加细胞凋亡(P<0.01),减少细胞衰老(P<0.01)。③与Gef单用组相比,Res联合Gef组cleaved caspase-3、 LC3BII、p53;和p21的蛋白表达水平显著增高,分别为Gef组的7.2倍(P<0.01)、7.3倍(P<0.01)、3.6倍和3.5倍(P<0.01),而对Beclinl的蛋白表达无显著影响(P>0.05)。结论：Res与Gef联合通过上调PC9/G细胞的p53和p21表达,诱导细胞自噬和衰老,阻滞细胞于G2/M期,进而抑制PC9/G的增殖,亦可通过caspase-3途径诱导细胞凋亡。提示Res主要通过诱导细胞的自噬和衰老,协同Gef克服PC9/G细胞耐药。