据统计,全球有约11亿人吸烟,15岁以上男性的吸烟率超过30%,女性超过6%,因此,烟草仍然是世界人口健康的威胁。中国是烟草消费大国,目前男性的吸烟率为47%、女性为2%,但二手烟暴露的比例都接近50%,吸烟造成每年约630万人死亡。香烟烟雾是人类最常接触的外源有害因素,可引起人体广泛损害。在吸烟相关疾病导致的死亡中,心血管疾病占40%、肺癌占20%、慢性阻塞性肺炎占20%、其它占20%,形势十分严峻。吸烟引起的肿瘤备受关注,尤其吸烟与肺癌有关。吸烟导致肺癌已广为人知,我国人群的肺癌一半因吸烟而起。据报道,香烟烟雾中有超过5000种的化合物,已经确定的致癌化合物多达60种,主要包括多环芳烃(如苯并芘)、亚硝胺和芳香胺等。通常情况下,这些致癌物质多为前致癌物,需要生物转化过程中的Ⅰ相代谢酶(主要为细胞色素P450酶,CYP)的代谢激活才能发挥致癌作用。CYP2A13是近年发现的一种主要在呼吸系统表达的肝外代谢酶,主要分布在气管和支气管的上皮细胞,在气管和支气管的平滑肌细胞也有少量表达。我们近年来的研究表明,CYP2A13可以代谢AFB1,其介导的代谢活化在AFB1所致细胞毒性、DNA加合物形成、DNA损伤、细胞凋亡以及细胞恶性转化中发挥着重要的作用。人群研究也证实,低活性的CYP2A13变异体(R257C)能够降低肺癌(腺癌)发生的风险。CYP2A13与香烟烟雾致癌物的代谢有关,4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-P吡啶基)-1-丁酮(NNK)是香烟烟雾中最著名的一种肺致癌物,CYP2A13在肺部代谢活化NNK中起了关键作用。香烟烟雾中存在多种其它CYP2A13酶的底物,例如,尼古丁、苯并芘、萘、3-甲基吲哚(3-MI)等。由于尼古丁在香烟烟雾中的含量较高,其本身以及被CYP2A13代谢后的产物毒性低,因此,在香烟烟雾化合物中,尼古丁可能通过大量消耗CYP2A13酶,而影响代谢含量较低的化合物如NNK、苯并芘、萘、3-甲基吲哚等的活性,从而影响或掩盖了CYP2A13对香烟烟雾的代谢及其毒效应的评价。因此,通过去除尼古丁,可以有效地再现CYP2A13对低含量的有毒物质(尤其是间接致癌物)的代谢活性,为深入探讨CYP2A13在原位代谢香烟烟雾所致呼吸系统损伤和肺癌中的作用提供实验依据。迄今,未见相关的研究报道。本研究采用自制的吸烟装置,通过比较分析选取吸收效率较高的溶剂作为吸收液,制备香烟烟雾提取物(CSE),对代表物质尼古丁和NNK进行了定性和定量分析；采用高效液相色谱分离去除CSE中的尼古丁,并对比了CSE、CSE中的尼古丁部分和CSE中非尼古丁部分对稳定表达CYP2A13的人支气管上皮BEAS-2B细胞(B-2A13)以及空载支气管上皮细胞(B-V)的毒作用差异。初步探讨尼古丁对CYP2A13代谢活化CSE化合物的影响,为深入阐明CYP2A13在香烟烟雾所致呼吸系统损伤的作用提供线索。第一部分CSE制备及尼古丁分离目的选择一种吸收效率较强的溶剂制备CSE,利用超高压液相色谱-质谱(UHPLC/MS)对CSE中尼古丁和NNK的含量进行检测。利用高效液相色谱法确定CSE样品中尼古丁的位置并进行分离,获得CSE尼古丁部分(CSE-N)和CSE非尼古丁部分(CSE-O)。为后续评价尼古丁对CYP2A13代谢CSE的活性评价提供实验材料。方法1、香烟烟雾抽吸装置的组装及仪器稳定性检验参考资料组装简易的香烟烟雾抽吸装置,设定大气采样器流速75 mL/min,每支烟的燃烧时间控制在5min左右；检测吸收液处理前和处理后含量的变化以观察结果的稳定性。2、吸收液的确定选择四种有代表性的溶剂作为备选吸收液,采用预先设计的实验设计方案,每次抽吸3支香烟：在相同条件下,利用高效液相色谱对各吸收液的进行检测,并结合尼古丁的最佳波长,确定一种吸收效果较好的溶剂作为后续实验的吸收液。3、CSE制备及质量控制和尼古丁、NNK检测按照确定的实验方法制备CSE：大气采样器流速75 mL/min,串联两个多孔玻板吸收管,每个吸收管中加入10 mL吸收液,每次抽吸3支烟；将吸收液浓缩至3支／mL作为CSE样品的储备液。为了检验样品浓缩过程的稳定性,分别在浓缩前、后利用超高压液相色谱-质谱(UHPLC/MS)检测尼古丁、NNK含量,评价样品在浓缩过程中的稳定性。4、CSE中尼古丁的确定及分离通过不断优化高效液相色谱方法,使CSE中的各物质峰尽量分离。通过与尼古丁标准品的相对保留时间比对,确定CSE色谱图中尼古丁峰的吸收峰位置,对尼古丁出峰位置及附近的物质进行收集,作为CSE的尼古丁部分(CSE-N);其余的收集在一起,作为CSE的非尼古丁部分(CSE-O)。结果1、吸收波长的确定根据DU800型分光光度计在测定尼古丁在200-500nm扫描波长下的吸收,确定260 nm作为尼古丁及吸收液的检测波长。2、吸收液的确定当用高效液相色谱测定各吸收液在260 nm波长下的吸收情况,分析发现,相对于水、正己烷和甲醇,二氯甲烷作吸收液时,色谱图上出现更多的物质峰；扣除溶剂空白的峰面积后,其色谱图上物质的峰面积和也是最大的(p<0.01)。实验结果提示,二氯甲烷对香烟烟雾的吸收溶解能力相对较强。综合上述,选择二氯甲烷作吸收液能够达到对香烟烟雾更好的吸收效率。3、CSE制备及质量控制和尼古丁和NNK检测CSE经超高压液相和质谱(U-HPLC/MS)分析检测,其中的尼古丁含量为103.655±17.336μg/支,NNK含量为12.708±3.823ng/支；浓缩之后NNK含量为12.332±4.823328ng/支,尼古丁含量为97.763.20±17.158μg/支。结果表明,溶液稳定性较高,损失较少。4、CSE中尼古丁位置确定及分离高效液相色谱法检测尼古丁标准品得出,尼古丁的相对保留时间为20.208min。将CSE分成尼古丁部分(CSE-N)和非尼古丁部分(CSE-O)后,再用高效液相色谱分别检测两部分的尼古丁,发现CSE-O在20-23 min内没有明显的物质峰；而对于CSE-N,用优化的高效液相色谱法分析,CSE-N色谱图上存在与尼古丁保留时间相同的峰。第二部分CSE中的尼古丁对其所致B-2A13细胞毒性的影响目的通过比较经CSE、CSE-N和CSE-O处理的B-2A13和B-V细胞的毒效应、细胞凋亡、DNA损伤的差异,初步阐述尼古丁在CYP2A13代谢CSE及其致细胞损伤中的作用,为深入探讨CYP2A13在香烟烟雾引起呼吸系统损伤中的作用及相关的防治措施提供线索,也为吸烟的健康损害评价、控烟策略制定等提供理论依据。方法1、尼古丁、NNK对B-2A13和B-V细胞毒效应将浓度为0、1、10、 100、1000μM尼古丁和浓度为0、0.1、1、10、100μMNNK处理B-2A13和B-V细胞24h,采用CCK-8法检测细胞活性。2、CSE、CSE-N和CSE-O对B-2A13和B-V细胞的毒效应根据预实验的结果,分别用体积百分比为0%、3.33%(1/30)、5%(1/20)、10%(1/10)和20%(1/5)的CSE和CSE-N,以及0%、0.5%、1%和2%的CSE-O处理B-2A13和B-V细胞24 h；此外,用CSE-O与1μM 8-MOP联合处理B-2A13细胞24 h后,CCK-8法检测细胞活性。3、CSE、CSE-N和CSE-O对B-2A13和B-V细胞的凋亡作用用5%CSE、10%CSE-N和2%CSE-O处理B-2A13和B-V细胞24 h,流式细胞仪测定细胞的凋亡情况,Hoechst 33258染色观察细胞的凋亡。4、CSE、CSE-N和CSE-O对B-2A13和B-V细胞凋亡和DNA损伤相关蛋白表达的影响用5% CSE、10%CSE-N和2%CSE-O处理B-2A13和B-V细胞24 h,提取各细胞的总蛋白,采用免疫印迹法检测部分凋亡蛋白及DNA损伤修复蛋白的表达量变化。结果R1、尼古丁、NNK对B-2A13和B-V细胞的毒效应1000¨M的尼古丁处理B-2A13和B-V细胞24 h后,两种细胞的活性均未明显改变；100 μM浓度的NNK处理B-2A13和B-V细胞24 h后,B-2A13细胞活性下降至50%,B-V细胞的活性也下降至80%,表现出明显的细胞毒性,显示CYP2A13在代谢活化NNK所致的细胞毒作用中发挥了重要作用。2、CSE、CSE-N和CSE-O对B-2A13和B-V细胞的毒效应不同浓度CSE处理B-2A13和B-V细胞24 h后,两种细胞的毒效应均呈现剂量依赖性增加；在相同浓度下,两者之间的细胞活性差异不明显。用不同浓度CSE-N处理B-2A13和B-V细胞24h后,B-2A13细胞在0-10%浓度的CSE-N处理后表现出少量的生长或增殖；而B-V细胞的活性都在100%以上,表现为微弱的增殖效应。不同浓度的CSE-O处理B-2A13和B-V细胞24 h后,两种细胞的活性都表现为浓度的依赖性的降低,而B-2A13细胞的活性下降更显著,两种细胞的活性在1%-4%的浓度下均有统计学差异。8-MOP可抑制CSE-O所致的B-2A13细胞的毒性作用,使B-2A13细胞活性部分恢复,接近B-V细胞的活性。结果提示CSE和CSE-N对两种细胞的毒性效应基本没有差异,但CSE-O对B-2A13细胞的毒性要明显且受强于B-V细胞且受8-MOP的抑制,提示CSE中的尼古丁可影响CYP2A13对CSE的代谢毒性。3、CSE、CSE-N和CSE-O对B-2A13和B-V细胞的凋亡作用5%CSE、10%CSE-N和2%CSE-O处理B-2A13和B-V细胞24h,流式细胞仪与Hoechst 33258染色实验的结果均显示,相对于空白组,5%CSE处理24h可使两种细胞都出现近50%的凋亡；10%CSE-N处理24 h,两种细胞的凋亡率也没有出现明显增加；当用2%CSE-O处理24 h后,B-2A13细胞出现了20%左右的凋亡,而B-V细胞的凋亡率约为8%,接近于空白对照组。两种细胞之间出现了明显的差异,提示CSE中的尼古丁可影响CYP2A13代谢CSE后产生的凋亡作用。4、CSE、CSE-N和CSE-O所致B-2A13和B-V细胞凋亡和DNA损伤相关蛋白表达的改变5%CSE、10%CSE-O和2%CSE-N处理B-2A13和B-V细胞24 h后,细胞中出现了凋亡与DNA损伤修复的分子过程；CSE-O处理的B-2A13细胞中C-Caspase3、p-p53、p-Chk1、γ-H2AX、XLF蛋白表达量比B-V细胞更加明显;CSE-N处理对上述蛋白的表达影响不明显。结果提示,尼古丁可通过影响凋亡与DNA损伤修复相关蛋白的表达而影响CYP2A13代谢CSE所致的细胞毒效应。结论1.在水、正己烷、甲醇和二氯甲烷四种溶剂中,二氯甲烷对香烟烟雾的吸收能力最好,可作为CSE制备的吸收液。2.在本实验的条件下,采用超高压液相色谱和质谱(UHPLC-MS)检测CSE样品中尼古丁含量为103.655±17.336μg/支,NNK含量为12.708±3.823ng/支。3.根据尼古丁的相对保留时间,可以将尼古丁从CSE中有效的分离出来,获得含有尼古丁的CSE (CSE-N)和不含有尼古丁的(CSE-O)部分。与CSE和CSE-N相比,CSE-O对B-2A13细胞的毒性效应要明显B-V细胞,且上述效应可以被CYP酶的抑制剂8-MOP所抑制；相关的蛋白表达改变也存在差异。4.CSE中的尼古丁可干扰CYP2A13对CSE中非尼古丁物质(多为活性物质)的代谢活化效应。