酵母絮凝沉降是一种高效简便的固液分离方法,在工业生产中能够节约离心机的设备投资和运行能耗。此外,酵母细胞从微米尺度游离细胞絮凝形成适宜尺度的颗粒细胞后,能够在发酵罐中实现自固定化,不仅可以提高发酵系统的细胞密度和设备生产强度,而且细胞絮凝这一明显形态改变导致细胞之间的接触,有助于强化群体效应,改善其环境胁迫耐受性,使其适宜于高浓度发酵体系,利用高浓度底物,提高发酵终点产物浓度,减少发酵废水排放。本课题组采用原生质体融合技术选育的絮凝酵母SPSC01具有絮凝能力好、絮凝性状稳定及乙醇发酵性能优良等特点,已在燃料乙醇生产中得到应用,并获得国家发明专利。以此为实验材料,研究SPSC01的絮凝遗传背景,分离絮凝基因,建立改造发酵性能优良的酵母菌株,使其具有絮凝特征的技术平台,具有重要的理论意义和实用价值。首先基于可诱导的单拷贝Fosmid载体构建絮凝酵母SPSC01基因组文库,文库共包括4663个单克隆,插入片段的平均长度为38kb左右,文库的覆盖率约为SPSC01基因组大小的14.6倍。进而,,用两对引物进行分组PCR筛选SPSC01基因组文库,从160个分组样品中检测出19个阳性样品,通过进一步PCR筛选,获得5个包括SPSC01FLO1基因全长的阳性单克隆。序列分析结果显示,SPSC01FLO1基因全长为8049bp,编码2682个氨基酸,SPSC01Flolp的N端和C端与实验室酵母菌株S288C Flolp对应区域的同源性分别为93%和92%,但中间区域包含更多的重复序列,重复单元的数量为43个,比S288C Flolp多25个。在同源重组的基础上,利用PCR介导的基因敲除方法,在选择性标记KanMX4抗性基因两侧加上大约45bp絮凝酵母SPSC01FLO1基因的同源臂,然后电击转化絮凝酵母SPSC01,破坏絮凝酵母SPSC01的FLO1基因，G418（?）筛选获得的阳性转化子失去了絮凝特性,证明FLO1基因的表达使SPSC01表现出絮凝性状。HO基因负责酵母菌交配型的转变,其破坏不会影响酵母细胞的正常生长。构建整合表达载体pHO1-1,絮凝酵母SPSC01的FLO1基因在PGK1启动子和CYC1终止子的作用下,整合到游离酵母6525的HO位点，使其获得了稳定的絮凝性状,而空载体pHO的整合使游离酵母6525只表现出G418抗性,并没有发生絮凝。从絮凝酵母SPSC01中进一步分离子絮凝基因FLO9、FLO10和FLO11,并在游离酵母6525中进行了整合表达,序列分析和功能验证的结果显示,SPSC01FLO9基因全长为2904bp,N端区域831bp,C端区域1395bp,中间重复序列675bp,包括5个重复单元,比S288C的FLO9基因少了8个重复单元，其阳性转化子6525FLO9没有表现出絮凝性状；SPSC01FLO10基因全长为4221bp,N端区域906bp,C端区域1686bp,中间重复序列1629bp,包括18个重复单元A和5个重复单元B,比S288C菌株的FLO10基因分别多了8个和1个重复单元,其阳性转化子6525FLO10的絮凝状态为比较细小的颗粒；SPSCO1FLO11基因全长为3315bp,N端区域789bp,C端区域1392bp,中间重复序列1134bp,包括18个重复单元A和9个重复单元B,比酵母菌株S288C的FLO11基因各少了7个,其阳性转化子6525FLO11没有表现出丝状生长和絮凝性状。通过连续两周不添加G418的传代培养实验,考察了基因敲除和整合表达获得的酵母阳性转化子的遗传稳定性。随机挑选传代培养后的转化子,进行G418抗性和PCR检测,实验结果显示,所有传代培养后的阳性转化子,仍然具有良好的G418抗性,并且絮凝性状和絮凝基因能够保持良好的遗传稳定性。转化子6525FLO1的絮凝值大约为95%,受甘露糖抑制,属于Flol型,当温度在20-50℃范围内,pH在3.0-7.0,Ca2+浓度大于10mM时絮凝较好。转化子6525FLO10的絮凝值大约为85%,受甘露糖和葡萄糖抑制,属于NewFlo型,其最适絮凝条件为,温度低于50℃,pH在4.0-6.0之间,Ca2+浓度大于10mM。葡萄糖浓度为250g/L的高浓度发酵实验显示,经过48h的发酵,野生型酵母菌株及其转化子都到达了发酵终点,残糖浓度均在1g/L以下,发酵液中的乙醇浓度为110g/L左右。当酵母细胞形成较大的絮凝颗粒时,由于传质阻力影响,葡萄糖消耗和乙醇生成速率略有下降,但并不影响菌体生长,野生型及其转化子的生物量没有明显的差别。综上所述,本文基本阐明了融合株SPSC01的絮凝分子机制,分离得到了4种絮凝基因,进行了序列分析,并通过基因敲除以及在游离酵母菌株中的整合表达,验证了絮凝基因的功能,为构建发酵性能优良,适宜乙醇及其他发酵产品生产的絮凝酵母工业菌株奠定了基础。