大豆是优质的植物蛋白资源,适合不同年龄的人群,但是大豆蛋白也是八大食物过敏原之一,全世界大约有0.3%-0.4%的人口对大豆过敏,严重影响了大豆过敏人群的健康。其中,大豆中的大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)被认为是大豆中的主要过敏原。本课题采用糖基化修饰来降低大豆制品的抗原性及过敏原性,为低致敏大豆制品的开发提供理论依据。首先建立检测抗原性和过敏原性的ELISA方法。采用间接竞争ELISA法测定31例大豆过敏患者血清IgE对两种大豆致敏蛋白glycinin和β-conglycinin的免疫特性,选取对大豆蛋白过敏原具有较高特异性IgE的25例阳性血清混合制成血清池,用于样品过敏原性的测定。此外,进一步确定了间接竞争ELISA法测定glycinin和β-conglycinin抗原性及过敏原性的抗原最佳包被浓度与抗血清稀释倍数。其中,对于抗原性测定,glycinin和β-conglycinin的抗原最佳包被浓度分别为0.025 μg/mL和0.3μg/mL,兔抗血清稀释倍数均为1:10000;对于过敏原性测定,glycinin和β-conglycinin的抗原最佳包被浓度均为10μg/mL,大豆过敏患者血清的最佳稀释倍数都为1:2。选用木糖、乳糖、葡聚糖为三种糖基供体,研究在温度55℃,相对湿度79%条件下,糖基化不同反应时间下glycinin和β-conglycinin的抗原性与过敏原性的变化规律。结果表明,随着反应时间的增加,整体上糖基化产物的抗原性及过敏原性呈逐渐降低趋势。大豆分离蛋白-木糖复合物在蛋白与糖质量比3:1、反应温度55℃、反应10 h条件下,glycinin和β-conglycinin的抗原抑制率分别降低了 44.35%和62.53%,过敏原抑制率分别降低了 33.87%和46.37%;大豆分离蛋白-乳糖复合物在蛋白与糖质量比4:1、反应温度55℃、反应96 h条件下,glycinin和β-conglycinin的抗原抑制率分别降低了 32.37%和52.05%,过敏原抑制率分别降低了 18.97%和16.67%;大豆分离蛋白-葡聚糖糖复合物在蛋白与糖质量比3:1、反应温度55℃、反应11 d和10 d条件下,glycinin和β-conglycinin的抗原抑制率分别降低了 17.88%和35.06%,过敏原抑制率分别降低了15.83%和46.57%。免疫印迹结果表明,大豆蛋白经糖基化改性后抗原性有所降低。通过接枝度的测定以及SDS-PAGE电泳研究两种致敏蛋白的糖基化反应程度与分子量变化规律;采用圆二色谱、傅里叶红外光谱以及紫外吸收光谱技术综合研究了糖基化产物的结构特性与致敏性的关系。结果显示,随着反应时间的增加,接枝度呈增加趋势;SDS-PAGE证明了糖基化反应的发生,并生成大分子物质;紫外光谱研究表明大豆蛋白与糖发生了结合,不同糖链的引入使蛋白质肽链展开或折叠,其中芳香族氨基酸对紫外的吸收强度发生改变;红外光谱显示糖基化处理后大豆蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角及无序结构之间相互转化,分子的有序性降低;CD光谱也证明了糖基化修饰改变了大豆蛋白的空间结构。大豆蛋白结构的变化可能屏蔽或掩盖抗原表位,从而改变其抗原性和过敏原性。此外,通过动物免疫学试验评价了糖基化复合物的致敏性质。结果表明,大豆蛋白经糖基化修饰之后能降低BALB/c小鼠产生的IgE抗体含量,且抑制皮肤过敏反应的发生。