来源于卵巢组织的恶性肿瘤是最为常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,在常见的妇科的恶性肿瘤中,来源于卵巢组织的恶性肿瘤的发病率就占了四分之一,在我国仅次于发病率最高的宫颈癌,位列第二位,而死亡率更是占各种妇科肿瘤中的首位[1]。尽管多年来手术方式和治疗方法不断改进及应用,卵巢癌患者的5年生存率仍然很不乐观。多年来许多学者渴望尝试对卵巢癌发病的分子机制的研究寻找到新的治疗思路,以此开发出新型的抗卵巢癌药物。就目前而言寻找能够帮助提高临床化疗药物的敏感性,或者能够逆转化疗药物的耐药表现的药物是一种较为可行的办法[2]。近年来随着分子生物学的研究发现,在动植物界中广泛存在着一类非编码小RNA,称为MicroRNA (miRNA),对多种细胞生物体的mRNA转录后续阶段的基因表达以及增殖分化凋亡等生命过程有重要的参与管控作用[3]。许多的研究证明其参与了癌基因和抑癌基因相互作用过程中的基因表达,包括卵巢癌在内的肿瘤形成极可能与有关信号通路被miRNA参与了调整导致耐药性形成。因此判断其在卵巢癌的发生发展、耐药等病理进程中所起的重要作用,对卵巢癌的诊断、治疗以及判断评估有值得期待的临床价值[4]。研究显示miRNA在多肿瘤组织中表达失调,目前有研究证明microRNA-125b通过调控EIF4EBP1蛋白的表达抑制卵巢癌细胞的增殖。miRNA已经成为一个崭新的、有发展前景的卵巢癌治疗的新方向[5]卵巢恶性肿瘤易复发的特性是临床治疗失败的重要原因。临床上随着化疗进程的推进绝大多数患者都逐渐出现对多种化疗药物的耐受,并最终导致治疗失败。这种对某一药物和某些其他药物的耐受性同时形成的特殊的交叉耐药现象被叫做肿瘤的多药耐药作用(Multi-drug resistance MDR)。多药耐药是一种较多见的交叉的抵抗药物现象,分为天然性和继发性两种。一般认为耐药机制是多方共同作用的结果[6]。传统的机制研究认为主要包括细胞膜糖蛋白对药物的转运排泄增加、肿瘤细胞自身DNA修复能力增强、细胞的氧化和解毒酶系统能力上调等方面。比较公认的相关蛋白包括多药耐药基因及其编码的P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(Topo-Ⅱ)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、蛋白激酶C(PKC)、可溶性抗药性钙结合蛋白(sorcin)、Prion蛋白(PrPc)、葡萄糖基神经酰胺合成酶(GCS)、细胞因子诱导凋亡抑制剂(CIAPIN-1)、粘着斑激酶(FAK)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等等。各种蛋白的高表达是产生耐药的机制之一。其中MDR1(P-gp)口GST-π被看作预测肿瘤耐药的重要标志[7-8]。随着对MiRNA的研究发现,miR-27a与miR-451能够调节P-gp的表达,这可能是一个新的调控耐药机制[9]。但是目前尚无报道专门针对此机制调节的有效药物,因此能否使用天然化合物调节microRNA的表达从而抑制P-gp的表达尚无明确报道。使用天药物治疗疾病是人类自古以来的治疗方法。现代工艺虽然可以合成很多的药物成分,但是从天然药源中寻找和提炼有效成分和深加工仍然是极为重要的手段之一。在天然药物成分治疗肿瘤的实例中紫杉醇、鬼臼乙叉甙等就是最成功案例[10]。这种从红豆杉属植物中分离出的二萜类化合物表现出良好的抗肿瘤特性,其中以铂类药物联合紫杉醇的治疗方案成为临床上卵巢癌化疗的“金标准”一线方案。因此,继续寻找新的天然抗肿瘤药物仍然有可能的空间。上世纪50年代我国科学家从中药材葛根中提取分离获葛根素(Puerarin),化学名称是8-β-D葡萄吡喃糖-4,7二羟基异黄酮。根据传统中药理论中对于葛根升清阳、解酒毒的应用,多年来对葛根素的应用研究主要集中在心脑血管疾病、糖尿病及糖尿病并发症的治疗,股骨头坏死和防止骨质疏松、帕金森氏病、预防和治疗老年痴呆症等疾病等方面。随着分子生物学研究技术的不断提高,近年来发现葛根素具有抗细胞过度增殖的作用,并能在子宫内膜异位症治疗的研究中发挥积极的作用[11]。国内多个学者证实葛根素能够抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡及细胞周期停滞,在胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌、卵巢癌等多个肿瘤细胞的体外研究中,发现添加葛根素后能明显增加化疗药物的效果,并对P-gp和MRP蛋白表达减少等相关机制进行了探讨。因此我们推测葛根素可能具有逆转肿瘤多药耐药性的作用[12]。因此本课题尝试通过研究葛根素是否能够抑制卵巢癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,逆转耐药细胞株的抗药性等方面,探讨葛根素是否通过调控microRNA-125b的表达参与细胞增殖与凋亡,并进一步探讨P-gp/MDR 1表达调控途径是否受葛根素的作用从而逆转肿瘤多药耐药作用,希望就此工作为葛根素成为一种抗肿瘤增敏剂,逆转多药耐药作用的研究做出初步探讨。实验工作分以下三部分开展：第一部分葛根素对人卵巢癌细胞SKOV3的增殖及侵袭能力的影响目的：观察葛根素在体外对人卵巢癌细胞SKOV3细胞的侵袭能力、增殖能力、凋亡变化以及凋亡相关蛋白和侵袭相关蛋白表达的影响。方法：MTT法检测不同浓度葛根素对SKOV3的生长抑制作用;流式细胞仪(FCM)检测葛根素作用于卵巢癌细胞SKOV3的凋亡诱导情况;采用Transwell迁移实验及基质胶侵袭实验检测葛根素作用后卵巢癌细胞的侵袭能力变化;Western blot方法检测人卵巢癌SKOV3细胞中凋亡和侵袭、转移等相关蛋白的表达。qRT-PCR检测miRNAs分子基因表达水平变化。结果：1、应用MTT法检测不同浓度(40μg、80μg、160μg)的葛根素分别作用于人卵巢癌细胞SKOV324小时后的生长率,结果显示肿瘤细胞的生长均受到显著的抑制,并且呈浓度依赖性,浓度越肿瘤细胞的生长受抑制越明显(P＜0.001)。对葛根素进行不同培养时间观察发现,葛根素刺激时间越长,肿瘤细胞的生长抑制越显著(P＜0.001)。2、应用FACS法检测不同浓度(40 μ g、80μg、160μg)的葛根素分别作用于人卵巢癌细胞SKOV324小时后凋亡显著的增加,并呈现浓度依赖性表现,随着用药浓度的增高肿瘤细胞的凋亡越发明显(P<0.001)。3、应用western blot法检测不同浓度的葛根素分别作用于人卵巢癌细胞SKOV324小时后的凋亡相关蛋白caspase3、caspase9及su rvivin蛋白表达变化,结果显示不同浓度(40μg、80μg、160μg)的葛根素组与对照组相比,caspase3、caspase9蛋白的表达上调,并表现出浓度依赖性,随浓度增高肿瘤细胞的凋亡越明显(P＜0.001)。对比Su rvivin蛋白的表达则刚好相反。4、采用Transwell迁移实验及基质胶侵袭实验均可发现卵巢癌细胞SKOV3在葛根素作用后,与对照组比较其侵袭与迁移能力均有显著的下降,并且呈浓度依赖性,葛根素浓度越高肿瘤细胞的侵袭能力与迁移能力则下降越明显(P＜0.01)。5、应用western blot法检测不同浓度的葛根素分别作用于卵巢癌细胞SKOV324小时后的侵袭转移相关蛋白MMP-2、MMP-9和TIMP-1、 TIMP-2蛋白表达变化,结果显示与对照组相比,不同浓度的葛根素(40 μg、80μg、160μg)作用下MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白的表达降低,并且呈浓度依赖性,浓度越高肿瘤细胞的侵袭转移相关蛋白表达降低越明显(P＜0.001)。此研究在裸鼠移植瘤中也获得一致结果。结论：葛根素能够在体外和体内均可以抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖和侵袭能力,促进其凋亡,并具有浓度依赖性。同时体内试验结果表明葛根素能够抑制裸鼠移植瘤的生长作用。第二部分葛根素通过调控miR-125b抑制卵巢癌细胞增殖的机制研究目的：研究中药成分葛根素是否通过改变miR-125b的表达影响卵巢癌细胞的增殖。方法：实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测六条在卵巢癌中发挥作用的microRNA的表达水平;qRT-PCR检测miR-125b在卵巢癌组织和肿瘤细胞系中的表达水平;利用Lipofectamine2000分别将成熟miR-125b的模拟物、阻遏物及阴性对照转染到SKOV3等细胞,Western blot法检测抗凋凋亡蛋白Bcl-2表达,MTT、流式细胞术检测用药的同时干扰miR-125b对抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡能力的影响。结果：qRT-PCR结果表明葛根素上调miR-125b的表达;过表达miR-125b显著抑制卵巢癌细胞的增殖能力,下调抗凋亡蛋白Bc1-2的表达;干扰miR-125b有效逆转葛根素导致的细胞增殖和细胞凋亡及Bc1-2的下调。结论：在体外葛根素可能通过上调miR-125b的表达进而抑制Bcl-2的表达,从而抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖,促进其凋亡。第三部分葛根素注射液逆转卵巢癌细胞多药耐药性的体外实验研究目的：通过体外实验观察葛根素注射液对人卵巢癌耐药细胞系SKO V3/DDP细胞的多药耐药性的影响,并初步探讨其作用机理。方法：通过MTT检测观察葛根素对SKOV3的细胞毒性及其是否能够逆转SKOV3/DDP对DDP、5-FU和MMC多药耐药性。应用流式细胞仪检测使用葛根素前后细胞凋亡率的变化。Western blot法检测不同浓度的葛根素分别作用于卵巢癌细胞SKOV324小时后的凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax蛋白表达变化及耐药细胞SKOV3/DDP中MRD-1和P-gp蛋白的表达情况。结果：1.SKOV3/DDP细胞显示出对DDP较强的耐药性,耐药倍数为18.63;而对5-FU和MMC显示较弱的耐药性。应用MTT法检测不同浓度的葛根素分别作用于卵巢癌细胞SKOV3和耐药细胞SKOV3/DDP24小时后的生长率,结果显示与对照组相比,不同浓度(40μg.80μg、160μg)的葛根素对肿瘤细胞的生长均受到一定程度的抑制,且呈浓度依赖性,增加葛根素的浓度可使肿瘤细胞的生长受明显抑制(P＜0.001)。但耐药细胞的总体生长抑制程度较敏感细胞明显偏弱。2、应用Western blot法检测不同浓度的葛根素分别作用于卵巢癌细胞SKOV324小时后的耐药相关蛋白MRD-1及P-gp蛋白表达变化,结果显示添加不同浓度(40μg、80μg、160μg)的葛根素与对照组相比,肿瘤细胞的MRD-1及P-gp蛋白表达降低,并且呈浓度依赖性,葛根素浓度越高肿瘤细胞的耐药相关蛋白表达降低越明显(P＜0.05)。3、应用Western blot法检测不同浓度的葛根素分别作用于卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/DDP24小时后的凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax蛋白表达变化,结果显示不同浓度(40μg、80μg、160μg)的葛根素与对照组相比,Bcl-2蛋白表达降低,并且呈浓度依赖性,葛根素浓度越高肿瘤细胞的耐药相关蛋白表达降低越明显(P＜0.05)。而Bax蛋白表达则相反,Bcl-2/Bax比例随葛根素浓度增加而下降,肿瘤细胞凋亡增强。结论：葛根素能诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡及逆转耐药,其机制通过降低MDR-1、P-gp蛋白和Bcl-2的表达而增强Bax表达下降,诱导肿瘤细胞凋亡。