研究背景乳腺癌具有较高的发病率与死亡率,我国每年新增乳腺癌病例约30万,其中近30%的患者因此死亡,因此,在威胁女性健康的肿瘤中乳腺癌居于首位。乳腺癌还具有较高的转移发生率,其中骨组织是较为常见的转移部位。处于乳腺癌早期的患者,其骨转移发生率约为25%,而处于中后期的乳腺癌患者骨转移发生率高达80%,并且一旦发生骨转移,近80%的患者无法达到5年生存期。同时,骨转移也导致了严重的骨相关不良事件,使患者的生活质量受到极大的影响。因此,寻找乳腺癌发生骨转移的治疗靶点迫在眉睫。根据乳腺癌分子分型进行归类发现,不同类型的乳腺癌细胞,具有不同的器官转移倾向性,其中三阴性乳腺癌较容易发生脑转移及肺转移,而导管型的乳腺癌发生骨转移比率较高。根据以上特性,本研究通过分析TCGA数据库中乳腺癌的临床数据,发现在导管型乳腺癌中,补体激活产物C5a及其受体C5aR2的表达量较其他类型显著升高。而补体系统既参与了肿瘤相关的免疫反应,又是肿瘤微环境的重要组成部分。当机体出现肿瘤后,炎症反应也随之而来,其中固有免疫系统首先被激活,作为固有免疫系统的重要部分,补体系统的活化更是首当其冲。在补体活化过程中,会产生大量的补体激活产物,其中的过敏毒素可扩散至机体各个部位而发挥作用,而过敏毒素中C5a的强度和影响力居于首位。因此,补体激活产物C5a及其受体在乳腺癌发生骨转移中的调控作用与机制,是本研究重点关注的内容。研究目的1、明确补体激活产物C5a/C5aRs与乳腺癌发生骨转移的相关性;2、探究C5a/C5aRs在调控乳腺癌发生骨转移相关微环境中的作用;3、探索C5a/C5aRs调控乳腺癌发生骨转移的分子机制。研究方法1、首先,利用TCGA数据库,对于乳腺癌相关的临床数据进行分析,重点关注了导管型乳腺癌基因的表达情况。进一步通过生物信息学的方法分析了,补体激活产物C5a及其受体与乳腺癌发生骨转移的相关性。随后,利用具有骨转移倾向的乳腺癌细胞系与乳腺癌骨转移病灶的标本,通过Q-PCR的方法检测了,补体激活产物C5a及其受体的基因表达量。随后,本研究通过免疫组织化学(IHC)和酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法,明确了C5a及其受体在蛋白水平的表达量。最后,通过动物实验,观察了C5a/C5aRs通路与乳腺癌发生骨转移的相关性,利用sh RAN干扰的方法分别敲减了乳腺癌细胞系BT474的C5aR1、C5aR2,并通过左心室注射乳腺癌细胞的方法构,构建了乳腺癌发生骨转移的动物模型,并观察了动物骨转移发生的情况,以及骨免疫微环境的变化情况。2、通过构建乳腺癌转移前微环境的动物模型,观察了C5a/C5aRs通路在乳腺癌发生骨转移前微环境中的作用。主要观察了C5a/C5aRs通路在乳腺癌细胞迁移以及增殖中的作用。随后,通过成骨细胞分化、破骨细胞分化以及破骨细胞前体细胞的招募实验,明确了C5a/C5aRs通路在调控骨微环境中的作用。本课题亦利用了流式细胞术,检测了C5a/C5aRs通路在调控免疫微环境中的作用。3、在机制研究方面,首先,通过破骨细胞分化实验,发现补体激活产物C5a诱导乳腺癌细胞的条件培养基,在不同C5a受体的表达水平下,其促进破骨细胞分化的功能也随之改变。随后,通过蛋白芯片筛查的方法,富集到影响较为明显的信号通路,并通过加入相关信号通路抑制剂的方法,验证了蛋白芯片的结果。亦通过免疫印迹试验(Western Blot)对ERK信号通路磷酸化进行证实。从蛋白芯片分析的结果中,分别筛选出与骨微环境和免疫微环境相关的差异蛋白,OPN与PD-L1。在验证蛋白芯片结果的实验中,通过Q-PCR的方法进行了OPN与PD-L1基因表达的检测。本研究进一步通过OPN与PD-L1中和抗体的使用,在蛋白质水平进行了验证。研究结果1、通过分析TCGA数据库发现,在导管型的乳腺癌中C5a/C5aR2呈现高表达的状态,并且通过生物信息学分析表明,C5a/C5aRs高表达的乳腺癌患者,更容易发生骨转移,而且相对于原发灶,在乳腺癌发生骨转移的病灶中,C5aRs亦呈现高表达的状态。在具有骨转移倾向的乳腺癌细胞系以及乳腺癌骨转移灶的标本中,也检测到C5a/C5aRs表达水平较高。在临床病例中还发现,乳腺癌发生骨转移患者的血清中,补体激活产物C5a的含量较原位癌患者升高,通过免疫组织化学的方法发现,在乳腺癌发生骨转移的病灶中,C5aR1、C5aR2的表达量和原发灶相比,呈现高表达的状态。在动物实验中,分别敲减了C5aR1、C5aR2的乳腺癌细胞,其骨转移发生率下降,并且骨髓免疫微环境中的MDSCs数量减少。2、本研究通过直接加入补体激活产物C5a,以及加入C5a诱导乳腺癌细胞后收集的条件培养基,分别对于C5a/C5aRs通路,调控乳腺癌骨转移相关微环境进行了研究,结果表明C5a/C5aRs通路可以促进乳腺癌细胞的迁移和增殖,并且在调控骨微环境方面还发现,C5a/C5aRs通路可促进破骨细胞前体细胞的招募以及促进成骨、破骨细胞的分化,并且在免疫微环境中,C5a/C5aRs通路还具有抑制CD4~+T淋巴细胞增殖以及招募MDSCs的功能。3、C5a诱导敲除C5aR1、C5aR2的乳腺癌细胞后,相较于对照组,其条件培养基促进破骨细胞分化的功能减弱。通过蛋白芯片分析条件培养基,并在KEGG富集后,发现影响较为明显的信号通路为PI3K-AKT以及MAPK信号通路。通过加入上述信号通路的相关蛋白抑制剂后发现,C5a诱导的乳腺癌细胞所收集的条件培养基中,加入ERK抑制剂组,较明显地抑制了条件培养基促进破骨细胞分化的功能。在免疫印迹实验中同样发现,C5a可以调控乳腺癌细胞ERK蛋白的磷酸化。分析条件培养基中的差异蛋白发现,在骨微环境以及免疫微环境中,表达差异较为显著的蛋白分别为OPN和PD-L1,并在加入C5a诱导后,OPN与PD-L1在m RNA水平表达量呈浓度依赖性升高,而在分别敲减乳腺癌细胞C5aR1、C5aR2以及加入ERK抑制剂后,OPN与PD-L1在m RNA水平表达量均下调。本研究通过加入OPN中和抗体后发现,C5a诱导乳腺癌细胞后所收集的条件培养基,促进成骨细胞分化的功能减弱,还发现加入PD-L1中和抗体后,条件培养基抑制CD4~+T淋巴细胞增殖的功能亦减弱,并且联合使用两种中和抗体后发现,抑制条件培养基招募MDSCs的功能较单独加入,得到了进一步的抑制作用。研究结论通过本研究表明,补体激活产物C5a及其受体C5aRs,与乳腺癌发生骨转移存在着密切的关系。在乳腺癌发生骨转移的过程中,C5a/C5aRs参与调节了乳腺癌骨转移相关微环境的形成,促进骨微环境中成骨细胞和破骨细胞的分化,同时也促进了肿瘤细胞的迁移和增殖,在骨髓免疫微环境中,C5a/C5aRs通路还发挥了免疫抑制的作用。相关机制研究表明,C5a与C5aRs结合后通过ERK信号通路调控PD-L1和OPN的表达,在乳腺癌发生骨转移过程中发挥了相应的作用。