唾液乳杆菌分离纯化、微胶囊制备及其在蛋鸡上的应用研究

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本文从蛋鸡肠道内容物中分离出一株益生菌,经生理生化鉴定和16s rDNA测序确定为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius),并将其命名为SNK-6。并以唾液乳杆菌SNK-6为对象,首先探究了其生长模型,以其生长模型为基础,探究了影响唾液乳杆菌生长的因素,确定了唾液乳杆菌的发酵条件。而在确定发酵条件之后根据饲料加工的工艺对唾液乳杆菌产品进行了优化,确定以羧甲基纤维素钠(sodiumcarboxymethylcellulose,CMC)、可溶性淀粉(soluble starch)、壳聚糖(chitosan,CS)制成的CMC-S-CS微胶囊的唾液乳杆菌微胶囊作为饲料添加剂产品。经过进一步的体内实验,在蛋鸡日粮中添加唾液乳杆菌微胶囊,初步探讨了其对蛋鸡生产性能、鸡蛋品质以及消化特性的影响。实验结果发现添加108 CFU/Kg的唾液乳杆菌微胶囊能够提高平均蛋重、小肠肠道绒毛形态和小肠淀粉酶和脂肪酶以及胰脏淀粉酶和脂肪酶的活性、哈夫单位和蛋白高度等鸡蛋品质。试验一唾液乳杆菌SNK-6的分离纯化及培养条件的优化利用蛋鸡回肠内容物进行厌氧培养,分离出一株乳酸菌,其菌落形态为乳白色、表面粗糙、不透明、边缘整齐,成熟菌落的大小为2 mm左右。革兰氏染色结果为蓝色,是一株革兰氏阳性菌,显微镜下呈长杆状或短杆状,胞内没有芽孢,胞体无鞭毛,表明此菌落为乳酸菌。能够利用果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、蜜二糖以及棉子糖等碳源;16s rDNA测序结果表明其与一株唾液乳杆菌BCRC 14759且同源性高达99.72%,综合鉴定结果表明此菌种为一株唾液乳杆菌。对唾液乳杆菌SNK-6进行生长曲线测定并利用非线性模型对其进行建模分析发现,其在41℃厌氧条件下符合Boltzmann sigmoidal和Gompertz增长模型,两种模型的拟合度R2分别为0.9881和0.9890,其生长曲线的拐点在7.91~8.78 h,且到达平台期的时间为16.26~17.03 h。此外,根据生长曲线计算出唾液乳杆菌繁殖一代所需的时间为0.94 h,Rmax为1.92 h-1。对唾液乳杆菌进行培养条件的优化得出,唾液乳杆菌SNK-6的最佳培养时间为12h。二次曲线拟合唾液乳杆菌SNK-6的MRS培养基的初始pH,拟合的R2值为0.9899,并计算得出其最适MRS培养基的初始pH值为6.53。通过测定不同装液量条件下唾液乳杆菌的CFU得出,唾液乳杆菌的最适氧气浓度为5.25%。试验二唾液乳杆菌微胶囊的制备及其稳定性检测通过优化工艺参数,探究了氯化钙和海藻酸钠制备微胶囊的最适浓度,并探究了不同微胶囊制作方法做唾液乳杆菌生物活性的影响。结果表明,微胶囊化氯化钙的最佳使用浓度为2%,海藻酸钠包埋的最佳浓度为4%。采用喷雾干燥、真空冷冻干燥和CMC-S-CS微胶囊等不同的方法进行了唾液乳杆菌微胶囊制备方法的探索。试验结果表明,采用CMC-S-CS制备的微胶囊其产品得率最高,且与喷雾干燥组、真空冷冻干燥组存在显著性差异(P<0.05),其次为采用甘油作为冷冻保护剂的真空冷冻干燥组,再次为采用脱脂牛奶作为保护介质的真空冷冻干燥组,随后为海藻酸钠微胶囊真空冷冻干燥组,最后为海藻酸钠微胶囊喷雾干燥组。4℃冰箱储存一周后,各产品的生物活性排序为:CMC-S-CS微胶囊>甘油真空冷冻干燥>脱脂牛奶真空冷冻干燥>真空冷冻干燥>喷雾干燥。4℃冰箱储存2周以后,各产品的生物活性排序为:CMC-S-CS微胶囊>脱脂牛奶真空冷冻干燥>甘油真空冷冻干燥>真空冷冻干燥>喷雾干燥。试验三CMC-S-CS唾液乳杆菌SNK-6微胶囊在蛋鸡上的应用探究了 CMC-S-CS唾液乳杆菌SNK-6微胶囊对蛋鸡生产性能、鸡蛋品质以及消化特性的影响。选取40周龄新杨黑羽蛋鸡480羽,平均分成3组,每组5个重复。Ⅰ组为基础日粮组;Ⅱ组为不含唾液乳杆菌的复合物添加剂组;Ⅲ组为含有唾液乳杆菌SNK-6的CMC-S-CS微胶囊添加剂组(10^8 CFU/g)。研究结果发现,Ⅲ组相比Ⅰ组的平均蛋重(P<0.01)、输卵管形态等有显著性差异;在实验第6周极显著地提高蛋重、鸡蛋长径、短径,降低蛋形指数(P<0.01),显著地提高蛋壳强度(P<0.05),在实验末期极显著提高蛋白高度、哈夫单位、蛋壳强度(P<0.01),显著提高鸡蛋长径(P<0.05),显著降低蛋黄颜色(P<0.05),显著降低4级暗斑率和3级暗斑率(P<0.05);显著提高十二指肠和空肠的绒毛高度、十二指肠、空肠的绒毛表面积、回肠绒毛表面积以及十二指肠绒隐比(P<0.05),显著提高胰脏的AMY、Try、LPS等消化酶的活性(P<0.05)、十二指肠食糜的AMY、LPS也显著提高(P<0.05)、十二指肠粘膜的AMY、LPS(P<0.05)、空肠粘膜的AMY活性(P<0.05)。
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