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黄曲霉毒素B1 (aflaxtion B1, AFB1)是由寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和产毒的黄曲霉(A. flavus)分泌的一种具有致癌、致畸、致突变毒性的次生代谢产物,常污染干果、花生以及玉米等农产品,对人畜危害很大,世界各国均制定了AFB1在食品和饲料中的限量标准。目前,检测AFB1的方法很多,其中免疫学检测方法具有快速、灵敏、特异性高等优点,是近二十年来的研究热点。无论什么检测方法,在进行AFB1分析时,一般都必须使用AFB1标准品,其价格昂贵,且操作人员存在一定的暴露风险,因此找到一种AFB1的替代品,建立无需使用AFB1标准品的(无毒)检测技术意义重大。根据免疫网络学说,抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody, Ab2)是免疫系统针对独特型抗体(Ab1)产生的抗体,分为四种亚型(Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2δ)。其中Ab2p是针对Ab1抗原结合部位的抗原决定簇产生的抗独特型抗体,能与Abl特异性结合,在分子空间构象上与抗原存在镜像(internal image)关系,因此Ab2β可以替代AFB1标准品,进而建立无需使用AFB1标准品的AFB1检测方法。目前主要集中于抗独特型多克隆抗体(PcAb2)的研究。本实验以抗AFB1兔血清为材料,通过酶切制备抗体Fab片段,免疫BABL/c小鼠,制备了PcAb2,并对其性质进行了分析。在此基础上,制备了抗AFB1抗独特型单克隆抗体(McAb2),并对其替代AFB1应用于检测分析进行了探索。具体结果如下：1.抗体Fab片段的制备采用50%和33%饱和度的(NH4)2SO4对抗AFB1抗体(IgG)进行分级纯化,采用间接竞争酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定抗体纯化前后的灵敏度分别为2.41 ng/mL和6.55 ng/mL在此基础上,考察了木瓜蛋白酶、半胱氨酸、pH值与酶解时间对酶解抗AFB1抗体制备Fab片段的影响,优化得到最适酶解条件为：抗体：酶(w/w)为1：50,半胱氨酸浓度为18mmol/L, pH6.5,37℃水浴反应30 min。在上述最适酶解条件下对纯化的抗AFB1 IgG酶解,使用蛋白A亲和柱去除酶解产物中的抗体Fc片段,纯化得到Fab片段,得率为0.35～0.45 g/g IgG。SDS-PAGE结果表明,Fab片段达到电泳纯。间接竞争ELISA法测得Fab片段对AFB1的灵敏度为0.77 ng/mL,比IgG的灵敏度(6.55 ng/mL)提高了7.5倍。2.抗AFB1抗独特型多克隆抗体的制备及其性质分析以抗AFB 1的IgG及其Fab片段分别免疫了3只BALB/c小鼠,编号分别为1-3(IgG为免疫原)和4-6(Fab片段为免疫原),制备PcAb2。间接非竞争ELISA测定各小鼠PcAb2的产生进程,结果表明,以IgG为免疫原第四次免疫(免疫间隔时间15d)后,2号小鼠PcAb2的效价最高,达到4.7×104；以Fab为免疫原,第四次免疫后6号小鼠PcAb2的效价最高,达到2.5×105。采用间接竞争ELISA研究了PcAb2与AFB1的镜像关系,结果表明,它们均能与包被抗原AFB1-O-OVA(AFB1肟与卵清白蛋白的连接物)竞争Ab1中AFB1的结合位点,表明PcAb2与AFB1存在镜像关系。3.抗AFB1抗独特型单克隆抗体的制备及其性质分析以抗AFB1抗体的Fab片段为免疫原,免疫BALB/c小鼠,第四次免疫(免疫间隔时间15d)后,将SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞进行融合,融合率达63%,通过间接非竞争ELISA法筛选分泌特异性McAb2的阳性克隆细胞,阳性率约为2.5%。采用有限稀释法对阳性克隆细胞进行多次亚克隆,筛选得到1株能稳定分泌抗体的单克隆细胞,编号2F5。采用单层细胞培养法和动物体内诱导法制备McAb2,间接非竞争ELISA测得细胞培养上清的亲和常数为4.88×109mol/L,细胞培养上清和腹水上清的效价分别为2.8×103和2.45×104。间接竞争ELISA分析表明,腹水McAb2与AFB1存在镜像关系,可与包被抗原AFB1-O-OVA竞争抗AFB1抗体(Abl)的抗原结合位点。根据达到相同竞争抑制率时AFB1和McAb2的浓度,分析得到两者对应关系的线性回归方程：y=6.10×10-5x-1.56(R2=0.9812)(x:McAb2的浓度,ng/mL；y:AFB1的浓度,ng/mL)。分别以AFB1和McAb2为竞争抗原得到的间接竞争ELISA标准曲线,对AFBl加标回收实验结果进行了分析,然后对两条标准曲线得出的回收率进行双侧t检验分析,结果无显著性差异,表明McAb2可替代AFB1标准品应用于ELISA检测分析。