目的:子宫内膜癌是发生于子宫内的一种上皮性恶性肿瘤,为女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。根据临床及病理观察结果将子宫内膜癌分为:Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型为雌激素依赖型癌,最常见的病理类型为子宫内膜样腺癌,这种类型大多数伴有前期子宫内膜增生和(或)子宫内膜上皮内瘤变,在持续单一雌激素刺激下产生。Ⅱ型为非激素依赖型癌,与临床雌激素刺激无关,主要源自萎缩或静止的子宫内膜,最常见的病理类型包括浆液性乳头状腺癌、透明细胞癌和癌肉瘤。Ⅱ型子宫内膜癌细胞异型性大,进展快,易出现深肌层浸润及淋巴结转移。关于Ⅱ型子宫内膜癌的信号传导通路是国内外研究热点,雌激素如何导致Ⅱ型子宫内膜癌的发生尚需深入研究。G蛋白偶联雌激素受体(G-protein coupled estrogen receptor,GPER)是一种膜结合的雌激素结合蛋白,其作用方式与经典的雌激素受体不同,主要通过介导雌激素作用活化其下游的快速非基因组信号通路(non-genomic signaling),其中包括MAPK/ERK、PI3K/AKT、c AMP、钙离子流动等发挥细胞生长、迁移、侵袭、血管形成等恶性生物学效应。由于能够与雌激素及其相关化合物结合介导快速非基因组效应,广泛参与调节身体各项生理活动,其结构、定位、相关信号转导通路以及与雌激素相关疾病的关系引起了研究者们的广泛关注。炎症微环境是肿瘤的重要特征之一,IL-6(interleukin-6)最早是由Muraguch等命名为T细胞替代因子,既可由淋巴细胞(如T细胞、B细胞)分泌,也可由非淋巴细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞等)分泌。许多抗原和非抗原性物质也可诱导、刺激IL-6的分泌,如细菌内毒素、一些中药单体和细胞因子等。信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)是一类双功能分子,既可以传导细胞信号,又可以激活基因转录。IL-6激活其下游的STAT3,诱导和维持肿瘤的炎症微环境,促进肿瘤的发生发展。研究表明,Ⅰ、Ⅱ型子宫内膜癌患者血清中的IL-6均处于高水平,Ⅱ型子宫内膜癌高于Ⅰ型,提示IL-6/STAT3通路可能在Ⅱ型子宫内膜癌的基因调控中发挥重要作用。有研究证明了雌激素能够通过MAPK/ERK信号通路促进细胞中IL-6的表达,故研究者推测,子宫内膜癌中可能存在GPER蛋白对IL-6/STAT3炎症信号通路的调控作用。本研究选用雌激素受体阳性表达的子宫内膜癌Ishikawa细胞、雌激素受体低表达的HEC-1A细胞、雌激素受体阴性的KLE细胞为研究对象,在体外试验中用17-β雌二醇(E2)、GPER特异性激动剂(G1)、GPER特异性拮抗剂(G15)处理细胞,检测其细胞培养上清中IL-6含量及GPER、P-ERK、P-STAT3的蛋白表达水平,从而探讨GPER蛋白对IL-6/STAT3信号通路的调控及该调控通路在子宫内膜癌发生发展的作用及可能的机制。方法:1细胞培育:人子宫内膜癌细胞株Ishikawa,以含有10%新生牛血清的1640培养基培养;HEC-1A、KLE细胞株,以含有10%新生牛血清的Mc Coys 5A培养基培养。两种培养基中各加浓度为100U/ml的青霉素及链霉素的双抗,培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内。以0.25%胰蛋白酶消化传代,细胞呈单层贴壁生长。2 ELISA法检测细胞上清中IL-6的分泌量。待培养瓶中细胞生长至80%~90%后,更换无牛血清培养基培养24h,分别用E2、G1及G15处理Ishikawa、HEC-1A、KLE三种细胞24h,调整终浓度达10-6mol/L,各组DMSO量至一致,最后得到对照组、E2处理组、G1处理组、E2+G15处理组、G1+G15处理组。收集细胞上清液,保存于-80℃冰箱,按ELISA试剂盒操作说明书检测样本。实验重复3次。3 Western Blot方法检测17-β雌二醇(E2)、GPER特异性激动剂(G1)、GPER特异性拮抗剂(G15)作用下的三种子宫内膜癌细胞中GPER、P-ERK、P-STAT3的蛋白表达。结果:1 E2及GPER特异性激动剂G1通过活化膜性雌激素受体GPER促进Ishikawa、HEC-1A、KLE细胞表达IL-6。ELISA法检测E2及G1对三种细胞上清液中IL-6的促分泌作用。结果显示,药物处理24h后,Ishikawa细胞中,E2及G1均促进了细胞上清中IL-6的分泌量,其中E2作用较G1显著(P<0.05)。HEC-1A及KLE细胞中,E2及G1均促进了细胞上清中IL-6的分泌量,其中G1作用较E2显著(P<0.05)。以上结果说明E2及G1通过活化GPER蛋白促进了三种细胞中IL-6的表达。2 GPER特异性拮抗剂G15对子Ishikawa、HEC-1A、KLE细胞中IL-6的抑制作用。ELISA结果显示E2+G15组、G1+G15组中E2和G1对细胞上清中IL-6的促进作用被显著抑制(P<0.05),其中HEC-1A及KLE细胞抑制作用明显。提示,HEC-1A及KLE细胞中,E2和G1对细胞上清中IL-6的诱导作用主要通过GPER发挥作用。3 Western Blot方法检测E2及G1对三种细胞中GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白的影响。GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白在三种细胞中均有表达。且在KLE细胞中表达量最高,差异有统计学意义。用浓度为10-6mol/L的E2及G1作用于三种细胞0min、15min、30min、45min、1h、2h,结果显示:Ishikawa细胞中,E2促进了GPER、P-ERK、P-STAT3三种蛋白的表达,15min时开始升高,30min时达最高(P<0.05)。G1仅对GPER蛋白表达量有上调作用,对P-ERK、P-STAT3蛋白上调作用不明显,说明在Ishikawa细胞中,E2主要通过ER介导的相关信号通路发挥作用,而GPER不起主要作用。HEC-1A及KLE细胞中,E2及G1对GPER、P-ERK、P-STAT3三种蛋白表达量均有上调作用,15min时达最高,其中G1作用显著,差异有统计学意义。4 Western Blot方法检测GPER特异性拮抗剂G15对E2及G1作用下的子宫内膜癌细胞中GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白表达的影响。用E2+G15、G1+G15分别处理Ishikawa细胞30min、处理HEC-1A及KLE细胞15min。结果显示:G15对E2及G1作用下的HEC-1A、KLE细胞中三种蛋白的上调作用的抑制尤为明显,差异具有统计学意义;而对Ishikawa细胞中GPER蛋白表达有下调作用,对P-ERK、P-STAT3蛋白的表达无明显下调作用(P>0.05)。提示,在HEC-1A、KLE细胞中,GPER、P-ERK、P-STAT3在一条信号通路上。结论:1 E2及G1通过活化膜性雌激素受体GPER促进细胞中IL-6的表达,且在HEC-1A及KLE细胞中,即Ⅱ型子宫内膜癌细胞中作用明显。2雌激素通过活化膜性雌激素受体GPER介导了子宫内膜癌中的“非转录效应”,并通过GPER蛋白介导了IL-6/STAT3信号通路的激活。3在Ⅱ型子宫内膜癌中,GPER特异性拮抗剂G15能够明显抑制GPER蛋白介导的IL-6/STAT3炎症信号通路。因此GPER及其拮抗剂G15有可能成为治疗Ⅱ型子宫内膜癌的新靶点及新靶向药物。