荧光探针是由荧光团(主体),识别基团(客体)和连接基团所组成的。到目前为止,荧光分子探针的设计原理主要根据荧光淬灭的机理,有以下几种:光致电子转移(PET),分子内电荷转移(ICT),荧光共振能量转移(FRET),激发态分子内质子转移(ESIPT),聚集诱导发光(AIE)等。其中,PET机理是分子设计领域最常用的荧光淬灭机理,当主体荧光团和客体之间发生非辐射电子转移时,荧光淬灭。PET又分为两种:受体激发的PET(acceptor-excited PET;a-PET)和供体激发的PET(donor-excited PET;d-PET)。a-PET是指客体HOMO上的电子向激发态荧光团HOMO转移;相反地,d-PET是指激发态电子从受激发的荧光团LUMO转移到客体的LUMO上。目前验证和区分这两种机理的主要方法是依靠(含时)密度泛函理论计算,过程繁琐复杂,故开发一种PET荧光分子探针的快速判断方法具有重要的理论意义和价值。由于荧光团和客体基团上的相对电子云密度存在差异,不同的荧光团与相同的客体相连接,可以达到不同的检测效果;同样地,相同的荧光团与不同的客体基团相连接,往往也会得到不一致的结果。因此,可以建立一种基于主客体电子云密度差的方法来判断是否存在PET机理。实际上,利用PET机理设计各类探针用于检测生物小分子和大分子也是最近报道的热点。本文基于rosamine设计合成了三类分子,并对其光学性质及生物学应用进行了深入研究。主要分为三个部分:第一部分主要基于经典的有机价键理论建立PET荧光探针分子设计的简便方法,后两个部分主要从细胞器靶向功能的角度研究生物分子的检测,具体内容如下:1.将不同电性的杂环与派洛宁相连接得到5个rosamine衍生物(探针3a-3e),分别研究了它们的p H响应。派洛宁与供电子的吲哚基团相连接时,a-PET过程被开启;然而当吲哚被质子化时,PET被禁阻。当派洛宁与吸电子的喹啉或吡啶基团相连接时,d-PET禁阻,荧光开启,而在强酸性条件下杂环上的氮被质子化后生成强吸电子的鎓盐,d-PET允许,荧光淬灭。5种红外荧光p H探针都具有高选择性,快速响应和很好的可逆性,可用于溶液中的p H荧光滴定。其中,探针3d的相对荧光强度增强了263倍,针对探针3d进行生物相容性改进的探针3e具有合适的p Ka,因此在V79和He La细胞中具有溶酶体靶向能力,并且3e为ON-OFF型探针,在正常细胞和癌细胞中分别展现出强弱信号,可用于酸性条件下细胞内的p H监测。研究结果表明:主客体的电子云密度相差越大,发生PET的可能性就越大,从而提供一种基于经典的有机价键理论而设计ON-OFF型荧光探针的简便方法。2.前期工作中设计的探针3c,利用不同的癌细胞和正常细胞进行染色,结果表明在绝大多数细胞中该分子为线粒体靶向探针。于是,用于检测线粒体中的重要小分子的新型的开启型荧光探针5和9被设计和合成。吡啶盐与派洛宁之间存在电子转移,d-PET被允许,荧光处于关闭状态。当外源性加入H2O2或H2S时,反应位点离去,游离的派洛宁-吡啶被释放,荧光开启。探针具备荧光量子产率高,红光发射,稳定性好,水溶性好等优点,可用于外源性检测溶液和细胞中的H2O2和H2S。探针5和9的检测限分别为57 n M和110 n M,均处于已报道探针中的中等水平。这项工作利用PET机理为细胞器靶向探针的发展提供了依据,对生物医学中靶向功能和药物输送的研究具有重要意义。3.继续沿用前期工作中派洛宁-吡啶盐骨架的线粒体靶向功能,设计了新型的OFF-ON型荧光探针11用于检测线粒体中的生物酶。在溶液中,探针11对硝基还原酶具有2.2 ng/m L的低检测限。常氧条件下,主要存在双电子还原的I型NTR;低氧条件下,主要存在单个电子还原的II型NTR。通过细胞成像可以区分开I型和II型硝基还原酶,整个检测过程也都在线粒体中进行。