昆虫病原真菌绿僵菌(Materhizium)作为杀虫资源的种类之一,不仅具备真菌杀虫剂的所有优点,还具有安全、制剂易生产、货架期长等优点,被广泛研究。据不完全统计,目前全世界超过200种农林害虫能被绿僵菌制剂寄生致死。然而,绿僵菌同其他微生物体农药一样,也存在一些不足,例如昆虫致死时间长,杀虫效率较低,防效不稳定等,严重限制其大规模应用。因此,系统深入理解昆虫病原真菌致病的机制,可为高效杀虫菌株的选育提供理论依据。G蛋白偶联受体(GPCRs)是一类非常重要的信号分子受体,是真核生物中最大的一类跨膜蛋白家族。G蛋白偶联受体在胞外信号向胞内转导的过程中起到重要的作用,调节控制着细胞内的基因转录,细胞运动和生长。可以说GPCRs调控着几乎所有已知的生理过程,例如激素、生长因子、神经递质、气味和光等介导的生理行为等都有G蛋白偶联受体的参与。所以说,在生物体中,G蛋白偶联受体有着不容忽视的重要作用。丝状真菌虽然作为真核生物中最低等的部分,但是它们确是对人类生命活动的各个方面产生了深远的影响,所以为了控制丝状真菌对人类不利的一面,充分利用其有益的特性服务于人类,就必须深入的了解其生理、遗传以及分子生物学方面的信息,并通过分子生物学手段对其进行有效改造。近年来有很多丝状真菌的全基因组测序已经完成或正在进行即将完成,于是乎对具体基因功能的研究就无可避免的成为了丝状真菌研究的一个热点,而这其中利用反向遗传学的方法来敲除基因是研究丝状真菌功能基因的常用方法之一。在对野生型罗伯茨绿僵菌(Mr23)孢子悬浮液进行40℃的水浴热激,并对热激后所形成的的表达谱的分析中,结果显示G蛋白偶联受体的基因表达是明显上调的,所以我们可以推测得知在绿僵菌的抗逆境过程中,G蛋白偶联受体起着很重要的作用。于是本文采取用结合基因敲除技术和农杆菌介导遗传转化技术来完成对野生型罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)体内G蛋白偶联受体的基因功能的预测。首先查找出GPCRs在基因组中的位置,并找到其上游及下游序列,构建敲除的载体,通过将敲除载体转化至根癌农杆菌AGL-1中,获得含有敲除质粒的农杆菌菌株,将农杆菌菌株与野生型罗伯茨绿僵菌(Mr23)共培养,筛选出阳性菌株,即获得了绿僵菌的敲除株,用同样的方法构建回补突变的农杆菌菌株,用其与绿僵菌敲除株共培养,获得绿僵菌回补菌株。将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△MrGPCR::MrGPCR)进行相应的生物学特性的测定,抗逆性能的测定和相应毒力能力的测定,观察比较,得出结论。从目前的状况看来,在真菌中GPCRs的应用还是有限的,所以,在绿僵菌中研究GPCRs还是很有前景与价值的。所以本文采用用基因敲除技术与农杆菌介导遗传转化技术来研究GPCRs在绿僵菌体内的功能是具有一定的理论意义与实践应用价值的,创新性很明显。主要的研究结果结论如下:1.在NCBI中查找出G蛋白偶联受体的序列,并找到在基因组中的位置,并且成功的构建了敲除质粒和回补质粒,获得了敲除菌株和回补菌株。2.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△Mr GPCR::MrGPCR)分别选取14天的菌种,并且将其配置成孢子悬浮液,选取30μL孢悬液涂板接种在1/4 SDAY、SDAY和PDA培养基上(包括3组技术重复和3组生物重复),分别于14天和20天计算其产孢量。结果可知,与野生型绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,敲除了GPCR的罗伯茨绿僵菌(△Mr GPCR)的产孢量有着明显的下降趋势。3.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△MrGPCR::MrGPCR)接种在SDAY培养基上,分别提取其RNA,查找相关产孢量的基因,并且通过实时荧光定量PCR方法,所得结果,可知大部分与产孢相关的基因都有下调趋势,也是从分子的角度验证了上述(结论2)产孢量有明显下降的结果。4.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△MrGPCR::MrGPCR)的孢子悬浮液点接在含有各种试剂的PDA培养基上,每隔相应的时间段观察其菌落生长直径。结果可知,与野生型绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,在NaCl、SDS、Congo red、H2O2和多菌灵抗性的培养基上,敲除了GPCRs的绿僵菌(△MrGPCR)对周围环境的逆境适应性变强了,即对逆境的敏感度下降了。5.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△Mr GPCR::MrGPCR)的孢子悬浮液均匀的涂在PDA培养基上,培养14天后收集孢子,配置孢子悬浮液,用新鲜配置的孢子悬浮液来浸泡大蜡螟,对大蜡螟进行体表侵染。所得结果,可知与野生型绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,敲除了GPCR的绿僵菌(△MrGPCR)的侵染大蜡螟能力减弱了,即毒力降低了。综上所述,敲除了G蛋白偶联受体的绿僵菌在逆境中适应性变强,产孢量减少,毒力减弱。