基于重水拉曼技术的根管冲洗液对粪肠球菌抑菌效能的研究

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目的:采用重水拉曼技术,以粪肠球菌ATCC29212(E.faecalis)为目标菌株,在单细胞水平上,非侵入性的定量评估不同根管冲洗液对E.faecalis代谢活性的影响,以便更合理的指导临床使用根管冲洗液,进而降低牙齿根管治疗失败的机率、难治性根尖周炎及细菌耐药性问题的出现。方法:培养目标菌株E.faecalis至稳定期,采用Bioscreen C测定不同浓度重水培养基中E.faecalis的生长周期。采用单细胞拉曼仪随机测量不同浓度重水培养基中E.faecalis细胞的拉曼图谱(SCRS),分析E.faecalis吸收代谢重水的情况,探讨重水拉曼技术对E.faecalis的普适性应用。在含30%重水的培养液中培养E.faecalis,按时间梯度进行取样,采用单细胞拉曼仪随机测量样品中E.faecalis细胞的SCRS,并计算重水峰所占比例(C-D ratio);采用紫外分光光度仪测量所取样品的OD600值,以确定重水拉曼技术定量检测根管冲洗液抑菌效能的重水浓度。采用稀释法检测E.faecalis在过氧化氢、葡萄糖酸氯己定和次氯酸钠作用下的最低抑菌浓度(MIC)。采用单细胞拉曼仪随机测量不同时间点、不同冲洗液浓度的重水培养基中E.faecalis的SCRS,以测定最低抑制代谢浓度(MIC-MA)。C-D ratio代表细胞的代谢活性,MIC-MA定义为使目标菌株在药物作用8h后的重水峰所占比例的变化(ΔC-D-ratio)均值≤0且标准差≤0.005的最小药物浓度。采用R(3.6.1版本)软件进行拉曼图谱分析。结果:(1)E.faecalis细胞的拉曼图谱在2,040到2,300cm-1区域出现明显的重水峰,重水峰的面积与培养基中重水的浓度成线性正相关关系(R2=0.9585,p<0.001);在30%重水的培养基中,E.faecalis生长既不会受到明显抑制(p>0.05),又能积极活跃的代谢重水。因此,选取30%重水浓度用于重水拉曼技术定量检测根管冲洗液对E.faecalis抑菌效能的研究。(2)在不同的根管冲洗液作用下,E.faecalis的最低抑菌浓度MIC的测量值依次为次氯酸钠(0.45g/L)、过氧化氢(110mg/L)和葡萄糖酸氯己定(6mg/L)。(3)E.faecalis细胞的C-D ratio随着根管冲洗液浓度的增大其升高的趋势逐渐减低。(4)在不同的根管冲洗液作用下,E.faecalis的最低抑制代谢浓度MIC-MA的测量值依次为次氯酸钠(0.9g/L)、过氧化氢(220mg/L)和葡萄糖酸氯己定(12mg/L),均高于MIC值;在冲洗液MIC浓度作用下,大部分(约2/3)的E.faecalis细胞仍有代谢活性。结论:三种冲洗液对E.faecalis均有抑菌作用,作用于E.faecalis的MIC-MA浓度均高于MIC。根管冲洗液能够抑制细菌生长的浓度未必达到完全抑制住细胞代谢活性的效果,提示我们E.faecalis虽然无法生长,但仍保持代谢活性,可能正是后期出现根管再感染、细菌耐药性问题及难治性根尖周炎的根源所在。重水拉曼技术能够在单细胞水平上,准确、定量的评估过氧化氢、次氯酸钠和葡萄糖酸氯己定对目标菌株E.faecalis细胞代谢活性的作用效果,以MIC-MA为量化指标定量评价抗菌药物疗效的同时也为精准化用药奠定基础。
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