论文部分内容阅读
光热治疗(Photothermal therapy,PTT)是一种新型的肿瘤治疗技术,其主要原理是在近红外(Near infrared,NIR)激光的照射下,光热剂可将吸收的光能转化为热能产生局部高温,从而对肿瘤组织造成不可逆的损伤。然而,当PTT作为独立的治疗手段时,会面临组织内热量分布不均导致疗效不理想的问题,因而PTT通常可与光动力治疗、放射治疗、基因治疗、免疫治疗等手段联合应用,通过不同的作用机制产生协同抗癌作用,抑制单一疗法的耐受性,显著提高治疗效果。为了在治疗中实现精准定位和可视化监控,医学诊断成像利用特定的探针或造影剂可以检测早期疾病,能够对肿瘤组织进行全面的评估。因此,一种全新的疾病治疗模式即诊断治疗学(Theranostics)理论得到了迅速发展,即通过对纳米材料的合理设计,将成像造影剂载入或掺杂到治疗模块当中,可以实时、精确地诊断病情并同步进行个性化治疗,从而实现肿瘤的诊疗一体化。目前各种临床医学成像模式,如X射线计算机断层扫描(Computed tomography,CT)、磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)、超声(Ultrasonic imaging,US)、正电子发射断层扫描(Positron emission tomography,PET)等都显示出其独特的优势。具有多种成像模式的纳米探针,能够获取具有互补性的可视化数据以实现深入的临床分析。因而致力于探索新型纳米复合材料并构建个性化诊疗平台,在肿瘤诊疗方面具有重要的研究价值。在众多多功能生物材料中,聚多巴胺(Polydopamine,PDA)作为天然生物色素——黑色素的主要成分,具有良好的生物相容性和较强的近红外吸收能力。基于聚多巴胺的纳米粒和纳米涂层,其表面的活性基团容易被巯基和氨基端分子修饰,在药物输送和多功能组件的偶联上显示出特有的优势。因此,赋予聚多巴胺纳米材料协同治疗和多模态成像的功能将会为纳米诊疗领域的发展带来突破。基于此,我们首先设计了聚多巴胺修饰的磁性普鲁士蓝纳米粒,用于多模态成像引导的光热和光动力治疗。对于光热治疗,普鲁士蓝(Prussian blue,PB)纳米粒子在近红外区域具有强烈的光吸收和较高的光热转换效率。与此同时,PB NPs被证明在光声(Photoacoustic,PA)成像方面具有很大的应用潜力。为了实现基于普鲁士蓝纳米材料的靶向诊疗一体化,本课题先以超顺磁性Fe3O4纳米粒子为核,在酸性条件下[Fe(CN)6]4-和Fe3+生成普鲁士蓝壳层沉积于Fe3O4纳米粒表面,从而得到磁性普鲁士蓝纳米粒(Magnetic Prussian blue nanoparticles,Fe3O4@PB NPs)以实现T2核磁成像和磁靶向引导的光热治疗。由于单一光热疗法难以根治肿瘤,我们引入光敏剂以实现光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)和光热治疗联合应用。铝酞菁(Aluminum phthalocyanine,Al Pc)作为第二代光敏剂,具有较高的单线态氧产率,较高的吸收波长,且可以作为荧光成像追踪剂。然而普鲁士蓝纳米涂层在药物传递方面存在局限性,以至于Al Pc难以直接封装或连接到PB表面。因而我们利用多巴胺的氧化自聚反应生成具有粘附性的聚多巴胺涂布于Fe3O4@PB NPs表面,可以有效地吸附光敏剂Al Pc,增加了光敏剂的稳定性。之后,在纳米粒表面包覆牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)能有效地延长其在生物体内的循环时间。本课题将紧紧围绕多模态成像介导的光热/光动力协同治疗,设计和制备聚多巴胺修饰的磁性普鲁士蓝纳米粒子(Fe3O4@PB@PDA),并实现了光敏剂Al Pc的运载和牛血清白蛋白BSA的表面包覆,最终合成目标复合纳米材料Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA。首先对所制备的纳米材料进行结构表征,Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA的透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)结果显示其形貌为球形,具有明显的核壳结构。X射线衍射测试出现的普鲁士蓝的特征衍射峰和紫外可见吸收光谱中的740 nm处的吸收峰均证实了Fe3O4@PB NPs的成功制备。红外光谱分析图中出现的PDA的特征吸收带可以证实PDA的成功包覆。从磁滞回线结果可以看出Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米材料均具有较好的超顺磁性。利用紫外可见分光光谱和荧光发射光谱验证了光敏剂的装载,且光敏剂呈现出近红外光触发的加速释药行为。体外升温实验中Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA表现出良好的光热升温效果和光热稳定性,光热转换效率达到22.3%。借助1,3-二苯基异苯并呋喃(1,3-diphenyl isobenzofuran,DPBF)验证了Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA可在短时间内产生大量单线态氧。在细胞水平,细胞毒性MTT检测和双染实验结果共同表明,基于Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA的光热与光动力联合治疗的对癌细胞的杀伤作用最强。利用单线态氧敏感探针DCFH-DA检测细胞内的单线态氧产生情况,结果表明,Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA处理的细胞内产生了最强的荧光信号,说明其能在细胞内产生大量ROS,预示着该处方具有潜在的增强光动力学治疗的作用。活体成像研究中,尾静脉注射12 h后荧光信号主要集中在肿瘤部位,说明Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA能够较好地靶向至肿瘤。该纳米复合物也在体内的核磁成像和光声成像中表现出显著的造影效果。小鼠的体内热成像实验数据表明,通过尾静脉注射Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA,在近红外光源的激发下,小鼠肿瘤部位在短时间内显著升温,温度可高达54℃。体内抑瘤实验结果证实了该处方能够通过光热治疗和光动力治疗的联合作用抑制肿瘤生长,且未对其他组织器官产生明显损伤。Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米复合材料主要优势如下所述:(1)多功能的Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米复合材料具有良好的生物相容性和超顺磁性,有利于在生理环境下实现磁靶向引导的光热治疗。(2)光敏剂通过π–π堆积和疏水作用被装载到纳米载体上,能显著增加Al Pc的稳定性和在肿瘤部位的积累,从而提高光动力治疗的疗效。(3)Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA可以作为一种多模态成像的纳米探针,能够实现肿瘤区域的近红外荧光成像,磁共振成像和光声成像。(4)Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米复合材料在单一近红外660 nm激光触发下的光热和光动力联合疗法能够明显的抑制肿瘤生长。考虑到近红外光对组织的穿透深度有限,而放射治疗(Radiotherapy,RT)可利用高穿透性的电离辐射(X-ray,γ-ray)作用于深部肿瘤,诱导DNA损伤,因此放疗结合光热治疗是一种极具吸引力的治疗手段。基于此,我们围绕聚多巴胺进行了更深入的研究,构建了嵌入硫化钨量子点(Tungsten sulfide quantum dots,WS2 QDs)的介孔聚多巴胺(Mesoporous polydopamine,MPDA)纳米材料。目前介孔聚多巴胺纳米粒是一种有效框架结构,其具有较大的表面积和较高的孔体积,有利于将多功能组件集成于一体,从而实现高效的诊疗一体化。钨元素由于其高原子序数,WS2 QDs可以作为放疗增敏剂,能在更安全的辐射剂量下增强放疗效果。同时,硫化钨对X-ray具有较高的光衰减能力,可被发展成为CT成像的造影剂。受到量子点嵌入介孔二氧化硅的组装形式的启发,我们尝试将WS2QDs装载到MPDA中,从而实现CT/PA成像指导的放疗和光热治疗一体化。由于肿瘤组织缺氧诱导的耐受性会严重阻碍放射治疗的疗效,我们进一步引入二氧化锰(Mn O2)纳米材料,使其与肿瘤部位的H+和H2O2反应生成大量的氧气以克服组织缺氧,同时该过程释放的Mn2+可以用于T1磁共振成像。本研究首先采用乳液诱导界面各向异性组装策略制备了聚多巴纳米海绵MPDA NSs,并将WS2 QDs嵌入MPDA NSs的孔道结构中,然后通过原位还原法包覆二氧化锰纳米壳,设计了一种新型自产氧的纳米诊疗剂(MPDA-WS2@Mn O2 NPs),用于光声、核磁、计算机断层扫描三模态成像介导的光热和放射治疗。首先对所制备的纳米材料进行结构表征,TEM图像显示MPDA NSs为单分散的介孔球,平均直径为~170nm,孔径约为9 nm。所制备的硫辛酸修饰的的WS2 QDs平均粒径为4~5nm;当WS2 QD掺入MPDA NSs时,其形态和分散性没有明显的变化,而孔道结构较为模糊。此外,MPDA-WS2-PEG通过PEG和KMn O4之间的氧化还原反应充当Mn O2纳米壳生长的位点,从而形成MPDA-WS2@Mn O2 NPs,可以看出MPDA的介孔结构被粗糙的Mn O2层完全覆盖。元素Mapping有不同元素(C,S,W和Mn)的分布,进一步验证了MPDA-WS2-Mn O2纳米粒子的成功制备。N2吸附-解吸等温线结果表明WS2 QDs嵌入MPDA NSs后,其孔径和比表面积明显减小。在Mn 2p的XPS谱图中,特征的Mn 2p3/2和Mn 2p1/2信号说明Mn(IV)O2纳米壳的形成。紫外可见吸收光谱表明该纳米材料在近红外区有明显的吸收。评价光热性能,在近红外激光照射下,MPDA-WS2@Mn O2 NPs表现出了优异的近红外光诱导的热效应和光热稳定性。通过定量测定在MPDA-WS2@Mn O2 NPs催化下H2O2溶液中的O2浓度,证明该处方具有很好的产氧能力。细胞MTT实验结果表明,随着MPDA-WS2@Mn O2 NPs浓度的增加,大多数细胞被NIR诱导的过高热杀死,而MPDA-WS2@Mn O2 NPs没有表现出明显的暗毒性。细胞双染实验进一步验证了MPDA-WS2@Mn O2 NPs诱导的过高热对细胞的杀伤作用。利用荧光探针ROS-ID来评估细胞内缺氧水平,用MPDA-WS2@Mn O2 NPs处理后细胞仅显示了极微弱的红色缺氧信号,表明该处方可以显著提升细胞内氧气浓度。采用克隆形成实验评估放射疗法的效果,表明MPDA-WS2 NP具有出色的放射增敏作用。进而使用γ-H2AX免疫荧光染色标记评价DNA损伤的程度,MPDA-WS2@Mn O2 NPs+X射线照射组产生了最强的荧光光斑,表明对细胞造成了高强度的DNA损伤。对MPDA-WS2@Mn O2的体外体内成像能力进行评价,MSOT成像、CT、核磁成像的信号强度均表现出较好的线性关系,并在体内产生了优良的造影效果。MSOT成像表明MPDA-WS2@Mn O2 NPs可以在静脉注射12 h后富集至肿瘤部位。近红外热成像表明,在激光照射下,注射MPDA-WS2@Mn O2 NPs后的小鼠肿瘤区域快速升温,说明该纳米材料可以在体内发挥有效的光热治疗作用。连续监测小鼠的肿瘤体积和体重,可以看出联合治疗能够显著抑制肿瘤生长,明显优于单一治疗的效果。H&E组织学分析表明治疗组的主要器官未见明显的组织损伤。MPDA-WS2@Mn O2 NPs的主要优势如下:(1)制备了具有大孔结构的MPDA NSs,并进一步探索其作为新型载体封装WS2 QDs的能力,在近红外光和X射线的触发下,能够实现光热效应与放疗增敏效应相结合的抗肿瘤治疗。(2)巧妙地利用PEG的还原性,以PEG修饰的MPDA-WS2 NPs为模板实现KMn O4的原位还原,获得了均匀的Mn O2纳米壳。Mn O2纳米壳能够与肿瘤微环境发生响应,缓解肿瘤组织缺氧,提高RT疗效,并释放Mn2+用于T1 MR成像。(3)制备的MPDA-WS2@Mn O2纳米剂将计算机断层扫描、多光谱光声断层扫描、肿瘤微环境响应的T1磁共振成像能力很好地整合与一体,能够在癌症治疗过程中进行实时的治疗指导和监测。放射治疗和光热治疗的协同作用能显著抑制肿瘤生长,表现出出色的治疗效果。