AtCAP1在根毛细胞膜泡运输中功能分析

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植物由于固着生长的特性,以及外界多变的生长条件使得植物生长发育的调节呈现复杂多样性。而细胞作为基本生命单位,对其生命活动调节机制的研究也被作为研究生长发育的重点。细胞生命活动离不开物质的合成与运输,这一切主要是在内膜系统中通过膜泡运输来完成的。拟南芥是生物学研究的模式生物,其根毛生长发育方式为极性生长。在根毛生长发育的过程中,大量的物质在尖端快速合成和聚集,膜泡运输在这一过程中起着非常重要的作用。拟南芥蛋白激酶 CAP1([Ca2+]cyt-associated protein kinase),属于 CrRLK1L 家族,参与拟南芥根部生长发育的调控过程。CAP1定位于液泡膜上,参与调控了由NH4+介导的信号传导途径,通过调节细胞内NH4+的平衡,来避免过多NH4+带来的毒害。CAP1缺失的T-DNA插入突变体cap1,根毛细胞尖端极性生长所需的Ca2+、pH和ROS梯度均发生异常,致使突变体根毛发育异常;但是当正常MS培养基中NH4+缺失时,cap1突变体根毛长度和密度,均恢复与野生型一致,细胞内各项异常发育都得到恢复。说明CAP1对根毛生长的调控与Ca2+、pH、ROS梯度确立以及NH4+信号有关。同时cap1突变体根毛细胞中,液泡发育、微丝排布及膜泡的分布和融合也会随着铵的缺失而恢复正常,表明CAP1与根毛细胞膜泡运输有关。由于根毛细胞特殊的极性生长方式,使得膜泡运输在根毛发育中极其重要。因此为了进一步探究细胞生长发育的机制,我们对根毛细胞的膜泡运输进行研究。首先为了研究铵与CAP1对根毛生长的影响,我们对不同铵浓度培养基上,野生型和cap1突变体根毛的生长进行实时观察。通过对根毛生长表型以及根毛生长速率的结果分析,发现铵可以调控根毛的生长发育,并影响液泡的形态;CAP1参与并调控了根毛的生长发育和液泡的形态发育,同时这一过程与铵有关。随后构建了根毛膜泡运输相关基因的活体荧光标记材料,再对不同铵处理培养基上生长的不同定位的野生型与cap1材料,进行荧光观察。实验结果表明:CAP1参与了高尔基体、反式高尔基体网、液泡和内体在根毛细胞内的发育和分布;铵参与了反式高尔基体网、液泡、再循环内体和初级内体在根毛细胞内的发育和分布;而内质网在细胞内的发育和分布,不受CAP1和铵影响。之后我们找到了内膜系统荧光出现差异时期的标记基因,对它们的单突变体材料分析发现,根毛长度与野生型均出现显著差异,说明膜泡运输对根毛的生长发育非常重要。通过杂交的方式得到了它们与cap1的双突变纯合体,发现双突变纯合体的根毛相较cap1突变体均有恢复,说明CAP1与这些膜泡运输的基因一起调控了根毛的生长发育。实验结果表明:CAP1参与NH4+对根毛和液泡发育的影响;CAP1和NH4+均参与并调控拟南芥根毛细胞内膜泡运输过程。
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