近年来,以念珠菌为主的深部真菌感染的发病率和病死率逐年上升。真菌耐药性的出现和迅速蔓延,降低了传统抗真菌药物的治疗效果,使得临床真菌感染治疗面临严峻的挑战。因此开发新型抗真菌药物,并积极寻找新的克服真菌感染和耐药的有效策略,是当今抗真菌感染研究的重要任务。苔藓植物广泛分布于自然界,生命力顽强,作为传统的药用资源,近年来已从中筛选出很多具有较好抗真菌活性的化合物。萜类是苔藓植物中被发现种类最多的化学成分,生物活性广泛,具有重要的应用价值。我们采用最低抑菌浓度筛选模型,对本课题组所建化合物库中的106个萜类小分子进行了初步筛选,从中发现了 5个具有较好抗真菌活性的小分子化合物,包括3个倍半萜类和2个二萜类小分子,对白色念珠菌的最低抑菌浓度均小于128 ug/ml。其中,从多苞裂萼苔Chiloscyphus polyanthus和白叶鞭苔Bazzania albifolia中均分离得到一种重排草蒲烯烷型倍半萜chiloscyphenol A(CA),该小分子抗真菌活性强、储存量多,用于开展更深入的抗真菌活性研究。经检测发现,CA对五种念珠菌均表现出杀菌活性,最低抑菌浓度为8～32 ug/ml,并且能有效抑制被膜的形成,对成熟被膜也具有一定的清除作用。实验结果显示,在CA作用下,白色念珠菌的线粒体膜电势和ATP含量发生显著改变,线粒体外膜蛋白Tom70呈异常分布,并伴有ROS的生成,过度累积的ROS进一步对线粒体和其他细胞结构造成氧化损伤。此外,采用荧光染色,透射电子显微镜(TEM)观察,以及钙黄绿素释放实验等多种方法检测发现,CA处理后的白色念珠菌细胞膜受到严重损伤,通透性增加。细胞形态皱缩的现象则进一步确证了CA对细胞膜的破坏作用。因此我们推断,CA通过损伤线粒体和破坏细胞膜发挥抗真菌作用。铜表面具有广泛的抑制或杀灭病原体的作用,将铜及铜合金应用到临床,是真菌感染防治的一个新思路。已有研究显示,铜及铜合金能在90 min内杀灭全部的浮游态白色念珠菌。本研究通过测定时间-杀菌曲线,发现金属铜对白色念珠菌成熟被膜也具有很好的杀菌效果。离子释放实验显示,铜片释放的铜离子浓度远远低于硫酸铜的有效作用浓度,说明铜自身释放的铜离子并非铜表面接触杀菌的决定性因素。通过荧光染色观察发现,在铜片的作用下,白色念珠菌被膜细胞内ROS迅速累积,并在一定时间内呈时间依赖性。此外,我们还发现被膜形成相关基因ALS1、ALS3的突变株所形成的被膜更加耐受铜片的清除作用。采用FDA/PI染色观察,未发现被膜内的细胞形态与细胞死活状态相关。另外,电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)分析结果显示,ALS突变株胞内铜离子浓度显著低于野生株。CRP1和CUP1是白色念珠菌细胞内与铜稳态调节相关基因,检测发现,铜作用后,ALS突变株的CUP1表达量无明显变化,而CRP1的表达量显著增加。综上所述,我们推测,铜表面与白色念珠菌被膜接触后,能在接触部位产生高浓度铜离子而损坏细胞膜,大量铜离子紧接着涌入细胞内,诱导ROS的累积,引起氧化损伤从而导致细胞死亡,而Als1和Als3蛋白能通过抑制铜离子外排泵CRP1的表达促进该过程。本论文通过筛选,得到了 5个具有抗真菌活性的萜类小分子,并以CA作为代表,阐述了倍半萜类天然产物的抗真菌活性及其作用机制,为开发倍半萜作为新型抗真菌药物提供了理论依据,也为今后研究其他倍半萜类化合物的抗真菌机制提供了一个很好的思路。此外,我们还确证了金属铜的抗真菌作用,第一次深入研究了金属铜对白色念珠菌生物被膜的清除效果,并发现了两个与被膜耐受铜相关的基因ALS1和ALS3,为推进铜材料在临床上的应用提供了一定的理论依据。