论文部分内容阅读
目的：利用脂肪酸对白芨多糖（BSP）进行疏水改性（hm-BSP）使之能够自组装形成纳米胶束，并以水飞蓟素（SM）为模型药物考察hm-BSP对难溶性药物装载、转运和释放性能，综合评价其作为纳米药物载体材料的安全性、可行性和可控性。 方法：（1）水提醇沉制得粗BSP，以还原糖得率为主要评价指标、通过单因素试验逐步优化酶法降解粗BSP的工艺参数；产物进一步经乙醇分级沉淀收集不同分子量段的BSP，并分析其黏均分子量，比较紫外和红外光谱图。（2）考察hm-BSP衍生物制备方法，核磁共振氢谱(1HNMR)和红外光谱(FTIR)对其结构进行表征。制备hm-BSP衍生物自组装纳米胶束，芘荧光探针法检测临界胶束浓度（CMC），透射电镜(TEM)观测形态，激光粒度仪测量其粒径及Zeta电位。以溶血性、细胞毒性和静脉给药的急性毒性为指标评价hm-BSP的安全性。（3）超声分散法制备载水飞蓟素纳米粒（SM-hm-BSP），以包封率为指标，单因素试验考察各制备条件，筛选出最优制备工艺。高效液相色谱(HPLC)测其载药量和包封率，激光粒度仪测其粒径与Zeta电位，TEM观测形态。考察其体外累积释放度；测试SM-hm-BSP细胞毒性，载香豆素6(C6-hm-BSP)细胞摄取量。 结果：（1）最佳酶解条件为配制20mg·mL-1的BSP溶液并调节pH为5.0，加入250U·mg-1的纤维素酶液，45℃保温振荡5h，煮沸5min灭活酶；体积分数50％、70%、90%（mL/mL）的乙醇逐步沉淀后可得黏均分子量约为5.3、3.7、1.1KD的BSP，紫外和红外光谱图无明显差异，3.7KD的BSP适于进一步改性。（2）采用有机系统制备hm-BSP衍生物：以DMSO为溶剂，利用N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)为脱水剂，4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂，将不同链长脂肪酸接枝在BSP分子链的羟基上，形成hm-BSP衍生物分别为hm-BSP-C12、hm-BSP-C16、hm-BSP-C18。1HNMR、FTIR均表明脂肪酸成功的接枝到BSP上，且hm-BSP-C18取代度最高。测得hm-BSP衍生物的CMC随脂肪酸链长而减小，分别为0.028mg·mL-1、0.040mg·mL-1、0.058mg·mL-1，粒径在250～400nm之间，Zeta电位均为中性。且hm-BSP-C18粒径最小为250nm，Zeta电位为–(0.57～0.07)mV，TEM观测其形态为球形均匀分布。测得hm-BSP-C18无溶血毒性和细胞毒性，小鼠静脉给药后，观察7d无死亡，生长状态良好，最大耐受量大于300mg·kg-1。（3）单因素筛选SM-hm-BSP最佳制备方法：hm-BSP-C18以2.5mg·mL-1浓度分散于蒸馏水，将加药量为10%载体量的SM溶解于0.5mL无水乙醇中，缓慢滴加至上述聚合物水溶液中，磁力搅拌24h后，冰浴超声10min(超声功率200W，工作2s，间歇3s)，溶液于3500rpm离心20min，上清液过0.45μm滤膜，得到载药纳米粒溶液。测得其载药量和包封率分别为7.31%±0.05%和78.86%±0.66%。TEM观测到其载药胶束呈均匀球形分。激光粒度仪测得粒径为(200.83±8.10)nm，Zeta电位为-（0.36±0.93）mV。SM-hm-BSP在37℃，pH=7.4PBS溶液中可持续释放8d，在165h时，释药量在90%以上，释放曲线符合Higuichi模型。CCK-8法测得其细胞毒性高于SM，且随时间变化较明显。C6-hm-BSP细胞摄取试验显示其摄取量明显高于游离C6。 结论：酶法降解粗BSP高效、简便、易于控制，醇沉分级产物疏水改性后，所得hm-BSP具有一定缓释作用和肝靶向性作用，为安全性良好的纳米载体材料。