Mdfic（MyoD family inhibitor domain containing）基因,是一个近年来新发现的基因,因其编码MyoD抑制素结构域（I-mfa domain）,故命名为Mdfic。然而,其研究工作仅限于cDNA序列的测序和Genebank的登录,对其功能研究仍是一片空白。在前期工作中,我们首次发现了Mdfic和同源异型框蛋白Rhox5间的相互作用,为其功能研究提供了新的线索。小鼠Rhox5为同源异型框基因,隶属于Rhox基因簇（reproductive homeobox on theⅹchromosome genes cluster）β亚簇。除在生殖系统的发育、精子的形成和成熟过程中发挥重要的作用外,多项研究表明其在肌细胞的发生和分化中担任重要角色,有可能作为MyoD基因的上游调控子或者和其他转录因子协同作用,调控肌细胞的早期发生和分化事件。Rhox5与Mdfic间的相互作用暗示了两者可能组成转录调控复合体在肌细胞发生和分化中发挥重要作用。本研究不仅研究新型转录因子Mdfic本身,而且侧重研究两种转录因子Mdfic和Rhox5间的相互作用。研究新型转录因子Mdfic的表达图谱,生物信息学分析其蛋白功能,将为新型转录因子Mdfic的功能性研究提供实验基础;研究小鼠Rhox5蛋白与新型转录因子Mdfic之间的相互作用,定位其相互作用的关键结构域;推测相互作用模式,这将为阐明新型转录因子Mdfic的功能及其与Rhox5蛋白的相互作用在肌细胞发生分化中的功能研究提供理论参考。本论文的实验结果及结论如下:1.Rhox5蛋白与Mdfic蛋白相结合经过酵母双杂交系统初筛,我们得到了一个与Rhox5相作用的分子:No.1-99。反向酵母双杂交实验和体外的GST-pull down实验结果表明Rhox5蛋白可以在酵母体内和体外结合No.1-99。使用Blast在线软件进行序列比对和搜索,发现No.1-99序列的cDNA序列与Mdfic（Mdfic）基因的C末端序列100%同源。PCR方法从小鼠7天胚胎cDNA文库中扩增全长的Mdfic的cDNA序列,并将其克隆至酵母双杂交载体BD和AD载体中构建重组质粒。双向酵母双杂交实验和体外的GST-pull down实验结果表明Rhox5蛋白可以在酵母体内和体外结合Mdfic。哺乳动物细胞的免疫共沉淀实验确认了哺乳动物细胞中生理状态下Rhox5与Mdfic的结合。这些结果均表明Rhox5蛋白在胞内可以与Mdfic相结合,而其C末端可能在其结合中发挥重要作用,但其相互作用的关键区域仍需要进一步的细化。2.Mdfic的表达图谱及生物信息学分析RT-PCR和荧光定量PCR检测小鼠10种组织:心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、小肠、胚胎（7-8天）和骨骼肌;NIH3T3细胞及诱导前后的C2C12细胞中Mdfic基因的表达情况差异,结果显示Mdfic mRNA在小鼠的肝、脾、肾和晕丸中有较高的表达水平,其余5个组织器官（心、肺、附睾、小肠、胚胎、骨骼肌）中的Mdfic mRNA表达水平相对较低,其中以附罩和小肠的表达最低。骨骼肌、诱导前后的C2C12细胞中Mdfic mRNA的表达水平,三者相比,Mdfic的表达水平存在:诱导前的C2C12细胞＞诱导后的C2C12细胞＞骨骼肌。生物信息学分析Mdfic基因组结构及其蛋白相关性质,结果表明:①Mdfic基因定位于第6号染色体15670661-15752165 bp区间的正链上。Mdfic基因总长度为81454bp,由5个外显子和4个内含子组成。外显子和内含子的连接处的序列均符合“gt-ag规则”。②通读框分析表明:Mdfic mRNA存在可选择性的翻译起始位点,除常规的位于338-390 bp的AUG起始密码子外,Mdfic mRNA的AUG起始密码子上游还存在潜在的非AUG起始密码子,即GUG,分别位于mRNA序列的第37-39 bp,70-72 bp和142-144bp。相对于AUG起始密码子起始翻译的蛋白来讲,非AUG起始密码子起始翻译的蛋白将原本的247 aa分别延长了82 aa,106 aa和117 aa,对应获得分子量为26 kD,34 kD,37 kD和38 kD的蛋白,根据其分子量,分别将这四种蛋白命名为Mdfic p26,p34,p37和p38。③生物信息学分析了这四种蛋白的翻译后修饰位点和二级结构预测,结果表明Mdfic p26,p34,p37和p38其共有的247 aa对应的翻译后修饰位点和二级结构基本一致。④亚细胞定位分析结果表明Mdfic p26,p34,p37和p38蛋白均主要定位于细胞核（可能性为52.2%）。⑤相对于Mdfic p26来讲,Mdfic p34,p37和p38蛋白延伸出的82 aa,106 aa和117 aa并未影响Mdfic p26的翻译后修饰位点、二级结构和亚细胞定位。⑥多序列比对的结果表明:Mdfic p26、HIC p32和XIC蛋白的同源性极其高,分别达到:81%、59%。他们均由AUG起始翻译,氨基酸残基数目相近,分别为247 aa、246 aa和246 aa,其C末端的I-mfa结构域,同源性高达95%以上。Mdfic p26、小鼠的I-mfa蛋白和人的I-mfa蛋白的氨基酸序列进行比对结果表明,Mdfic p26与小鼠的I-mfa及人的I-mfa的同源性也较高,尤其是其C末端的I-mfa结构域。推测Mdfic基因是HIC的鼠基因类似物（orthologue）,同属于I-mfa结构域家族,编码Mdfic或者可以称为MIC（Mouse I-mfa domain containing protein）。在该蛋白的功能发挥中,其C末端的I-mfa结构域可能发挥重要的功能。3.Rhox5与Mdfic相互作用的关键区域分析生物信息学分析Mdfic的氨基酸序列,根据分析结果PCR方法扩增了Mdfic A截断型片段,包含了第72-247位氨基酸残基,含有保守的I-mfa结构域;双向酵母双杂交和体外的GST-Pull down结果表明,该截断型片段可以与Rhox5蛋白结合,且结合力度较完整的Mdfic蛋白强,这表明与Rhox5蛋白结合的区域位于MdficA截断型片段内,而MdficA截断型片段外的区域（1-71 aa）的结构可能影响了Mdfic与Rhox5蛋白的结合。进一步,我们将Mdfic A片段细化为两段:Mdfic B,包含了第72-191位氨基酸残基,不含有I-mfa结构域:Mdfic C,包含了第191-247位氨基酸残基,含有I-mfa结构域。令人惊奇的是:含有保守的I-mfa结构域的Mdfic C截断型片段丧失了与Rhox5蛋白结合的能力,而不含有I-mfa结构域的Mdfic B截断型片段保留了与Rhox5蛋白结合的能力。此外,双向酵母双杂交和体外的GST-pull down实验均表明Rhox5 N截短型片段（不含同源异型域）不能与Mdfic蛋白结合;而Rhox5 C截短型片段（含有同源异型域）则保持了与Mdfic蛋白结合的能力。这些结果表明Mdfic可能通过Rhox5蛋白的同源异型域与其结合。本研究首次利用RT-PCR和荧光定量PCR检测小鼠10种组织:心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、小肠、胚胎（7-8天）和骨骼肌;NIH3T3细胞及诱导前后的C2C12细胞中Mdfic基因的表达情况差异,提出Mdfic的表达水平存在:诱导前的C2C12细胞＞诱导后的C2C12细胞＞骨骼肌,暗示了Mdfic可能在肌细胞分化中起负调控作用。生物信息学分析了Mdfic的功能,提出其I-mfa结构域在其功能发挥中担任重要作用。此外,研究首次证实了Mdfic与Rhox5蛋白的相互作用,提出Rhox5蛋白的同源异型域及Mdfic蛋白的非I-mfa结构域在Rhox5/Mdfic结合中起关键作用,并基于此得出了推论:Mdfic蛋白的I-mfa结构域可能与其他转录因子结合,调控该转录因子的活性;而Rhox5与Mdfic的结合极有可能进一步调控由Mdfic参与的其他转录因子调控,三者形成一个复杂的调控网络,共同参与肌细胞发生及分化的调控。