近年来,放化疗及手术等治疗手段广泛应用于恶性肿瘤的治疗,但这些常规治疗手段常常会伴随一定的副作用,在这种情况下,亟需开发更多的肿瘤治疗方法。其中,免疫疗法中的抗体类药物以其特异性、靶向性、多样性等众多优势被广泛地运用在肿瘤的治疗中。经典的抗体结构包含重链恒定区（CH）、重链可变区（VH）,以及轻链恒定区（CL）、轻链可变区（VL）,分子量大小在150k D左右。虽然抗体药物在临床上取得了一定的研究成果,但是其较大的分子量使得在很多情况下不具备良好的穿透能力,无法到达靶细胞或靶器官,因此不论是单克隆抗体药物还是抗体偶联药物,治疗效果都会出现一定的折扣。以抗体偶联药物为例,抗体需要有一定的穿透能力才能够将药物送达到靶细胞并发挥杀伤作用。因此,研发小分子抗体具有十分必要的意义。研究发现,在鲨鱼、驼科等动物的血清中存在着一种天然缺失轻链的重链单域抗体（Hc Abs）,Hc Ab结构中重链抗体的抗原结合区域,为单域可变结构,称为纳米抗体。纳米抗体属于一种特殊类型的抗体,在结构上,纳米抗体由约120个氨基酸组成的蛋白,分子量只有15k D左右。目前为止,纳米抗体是已知最小功能性抗原特异性的结合片段,具有以下特点与优势:1、纳米抗体是有3个抗原互补决定区（CDR区）和4个框架区域（FR区）组成的蛋白抗体片段。2、纳米抗体由于分子量较小,因此具有更强的组织渗透能力,可以有效抵达实体瘤等致密的组织,发挥出更优的与肿瘤细胞表面抗原的结合效果。3、纳米抗体稳定性更好,免疫原性更低,而且在血液中的半衰期相对来说更短,能够在一定的程度上避免毒性的积累。4、纳米抗体可以通过原核表达体系进行生产,易于通过基因工程进行改造。HER-2阳性乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤,易转移且预后较差,赫赛汀（一种治疗乳腺癌的上市抗体药）的问世改善了预后及治疗情况,但治疗有效率仅在25%左右,且部分患者会出现如心功能障碍等不良反应。因此,针对乳腺癌治疗遇到的问题,需要开发出新的抗体种类和结合位点,增加抗体药物梯队,为乳腺癌肿瘤治疗带来新的契机。在本课题研究中,我们通过噬菌体展示技术,针对肿瘤特异性标志物HER-2这一抗原,从纳米抗体噬菌体文库筛选出特定表位的纳米抗体,验证其在抑制肿瘤细胞增殖中的活性。同时,采用引入终止密码子的方式对筛选出的纳米抗体进行非天然氨基酸的修饰,本课题所选的非天然氨基酸为4-叠氮基-L-苯丙氨酸,其携带叠氮基基团,该基团可作为定点偶联毒素的连接子,为后续实验打下基础。以下是我们对实验结果的归纳与分析。一、筛选获得HER-2特异性纳米抗体（1）在噬菌体展示技术纳米抗体库中进行定向筛选,获得两个靶向HER-2特定表位的抗体序列1#-8B和2#-4G;（2）通过酶联免疫吸附测定实验鉴定出纳米抗体与HER-2蛋白抗原有结合能力,并确定纳米抗体和赫赛汀sc Fv片段的结合位点不同,增加了结合表位;（3）采用增殖实验进行抗体的功能性测定,筛选得到的目标纳米抗体可以有效地抑制HER-2阳性乳腺癌细胞BT474的增殖,其中1#-8B表现出43%-66%的抑制率;2#-4G表现出了47%-75%的抑制率;（4）通过分子水平的酶联免疫吸附测定,测量出纳米抗体的EC50值,其中1#-8B的EC50为10.5μg/ml,2#-4G为0.07μg/ml。二、对HER-2特异性纳米抗体进行非天然氨基酸修饰（1）通过将GGG突变为TAG的定点突变方法使得纳米抗体引入非天然氨基酸的修饰,根据蛋白电泳观察到完整的纳米抗体的产生,并继续验证;（2）运用扩充遗传密码子技术手段,利用正交性氨酰t RNA合成酶/t RNA（aa RS/t RNA）去识别m RNA上的终止密码子（也称无义密码子）,实现在设计的特定位点处插入选择的非天然氨基酸4-叠氮基-L-苯丙氨酸;（3）通过蛋白免疫印迹的方法验证出非天然氨基酸的成功引入,并在此基础上采用抗原抗体结合实验验证,经过非天然氨基酸修饰的纳米抗体仍然可以与抗原有着良好的结合活性。综上所述,本课题通过使用噬菌体展示纳米抗体库筛选技术,成功筛选到了2个靶向HER-2特定表位的纳米抗体,并且对这两条特定序列进行了多重验证,证明其与HER-2蛋白均有良好的结合活性,并可以抑制肿瘤细胞在体外的生长增殖,随后本研究在此基础上对这2个纳米抗体通过终止密码子引入了非天然氨基酸,使修饰后的纳米抗体具有叠氮基的特性,对未来进行定点偶联药物的研究做下了不可或缺的前期工作与基础。