诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell,iPSC)是近年来干细胞研究领域中具有里程碑意义的突破。由体细胞重编程而来的hiPSC为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径,是再生医学和组织工程、疾病模型、药物筛选的理想种子细胞,具有广阔的临床应用前景。而hiPSC体外培养条件是否合适则是决定其是否具有应用前景的前提,因此也是研究者关注的热点。hiPSC的培养包括了体细胞重编程为hiPSC的过程(称为hiPSC的诱导培养)和hiPSC的扩增培养两个过程。“合适”或者“理想”的hiPSC的培养条件不仅要在扩增培养时维持hiPSC的生物学特性、符合临床应用前景,还包括这种培养条件是否可同时支持体细胞重编程。目前主要使用小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)作为滋养层支持hiPSC的培养,但是这种含有鼠源性细胞的培养体系含有许多潜在的微生物感染风险,并且不可避免的带有异源细胞和蛋白,限制了hiPSC潜在的临床应用价值。因此,仍有待进一步探索“合适”或者“理想”的hiPSC诱导和扩增培养条件。我们关注于用人源性细胞作为滋养层用于hiPSC的诱导和扩增培养。第1章人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养hiPSC方法的建立和研究人间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell,hMSC)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,可以从少量的骨髓或其他许多组织样本中分离获得,可在分成纤维细胞重编程。因此,我们研究了自身成纤维细胞是否可作为滋养层支持hiPSC的诱导和扩增培养,并研究以自身成纤维为滋养层诱导培养的hiPSC的生物学特征。我们从两个需做包皮环切术儿童手术后废弃的包皮中分离到两株包皮成纤维细胞,对二者均进行了相关研究。将HFF转导携带有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc转录因子的逆转录病毒后,不再作消化收集,而是在原来的体系中用hiPSC培养液一直培养。我们观察到,转导病毒后,大部分的成纤维细胞形态上并没有发生改变,且仍具有较强的增殖能力。9-10天后,小部分成纤维细胞聚集成小簇,细胞形态变短变宽,向上皮样转变,核仁明显。约3周后,部分小簇形成较大致密的克隆样细胞团块。这些克隆挑选后可继续在自身HFF滋养层上扩增,形成典型的hESC形态。表明在重编程过程中,未发生有效重编程的自身成纤维细胞可以作为滋养层支持其他成纤维细胞的重编程。我们主要检测了扩增后其中一个克隆的特性,免疫荧光检测结果显示这些在自身HFF滋养层上培养的hiPSC表达未分化hESC特有的表面标记,如SSEA-4、 TRA-1-60、TRA-1-81和NANOG;RT-PCR检测显示内源性KLF4、SOX2、c-Myc. OCT4在这些hiPSC上均被激活,并表达NANOG、DNMT3B、hTERT、DPPA4和NODAL等多个多潜能基因；EB分化实验和畸胎瘤形成实验显示其在体内外均可形成典型的三胚层组织,具有向三胚层分化的潜能；此外,培养21代以上后,标准G-带核型分析实验显示这两个hiPSC克隆的核型均为46,XY,提示hiPSC在自身HFF滋养层上扩增培养后仍维持正常核型。本研究首次证实了转导了携带有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc转录因子的逆转录病毒后,未发生重编程的自身HFF可支持小部分HFF发生重编程。建立了一种用自身HFF支持hiPSC的诱导和扩增培养的人源化培养体系,为建立符合临床应用需要的hiPSC的培养方法提供了另一种更具有优势的可行途径,也为研究人成纤维细胞重编程机制提供了一个很好的模型。第3章不同滋养层对重编程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潜能影响的研究培养微环境涉及细胞、细胞外基质、细胞因子等各种成分,通过多种途径影响体细胞重编程和多能干细胞的生物学特征。其中滋养层细胞在培养微环境中起复杂而重要的作用。我们在研究用hMSC和自身HFF作为滋养层支持成纤维细胞的重编程和培养获得的hiPSC时,发现不同的滋养层对体细胞重编程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潜能均具有较明显的影响。我们比较了不同滋养层对成纤维细胞重编程效率的影响。通过三次重复实验,我们发现,HFF在以hMSC、自身HFF为滋养层的培养体系中重编程为hiPSC的效率分别是在以MEF为滋养层的培养体系中重编程效率的7.26%±2.09%(P<0.05)、37.08%±5.63%(P<0.05)。为了进一步明确导致这种差异的原因,我们用MEF条件培养液培养,但是HFF在以hMSC、自身HFF为滋养层的培养体系中重编程为hiPSC的效率并末提高(分别为8.52%±5.4%,35.98%±7.82%),仍然明显低于其在以MEF为滋养层的培养体系中的重编程效率。此外,我们检测了hiPSC克隆在hMSC、 HFF、 MEF这三种类型滋养层上的增殖情况,发现其平均扩增倍数分别为2.31±0.12(P<0.05)、2.66±0.17(P<0.05)、4.77±0.64。同时,我们发现以MEF为滋养层培养的hiPSC传代后培养至第5天时,大部分克隆仍维持未分化状态(未分化克隆占97.3%±1.15%)；至第7天时,出现小部分分化的克隆(未分化克隆占86.7%±6.81%)。而以hMSC、自身HFF为滋养层培养的hiPSC培养至第5天时,分化的克隆即明显增多(未分化克隆分别占77.3±10.1%、80.7±5.13%,P<0.05)；至第7天时,分化的克隆进一步增多(未分化克隆分别占64.3%±4.93%、67.3%±6.51%,P<0.05)。通过流式检测,我们发现在hMSC、自身HFF为滋养层培养7天后的hiPSC克隆中TRA-1-60阳性细胞比例(分别为75.6%±3.35%、74.9%±4.72%)均低于以MEF为滋养层培养的hiPSC克隆中TRA-1-60阳性细胞比例。本研究首次比较了不同滋养层对人成纤维细胞重编程效率的影响,发现在相同条件下,体细胞在人源性细胞滋养层上发生重编程的效率明显低于其在MEF滋养层上的重编程效率。但是,即使使用了MEF条件培养液,成纤维细胞在以hMSC. HFF为滋养层的培养体系中重编程为hiPSC的效率并未提高。同样,用hMSC、 HFF作为滋养层培养hiPSC时,hiPSC的增殖能力明显低于其在MEF滋养层上的增殖能力,且更易分化。需要进一步明确导致这些缺陷的原因,以及体细胞重编程、hiPSC自我更新能力和多向分化潜能维持的分子机制,以改进这种hiPSC的人源化培养条件,使其成为一种理想的培养条件。