背景:牙髓病、根尖周病的经典治疗方法是根管治疗,但因年轻恒牙根尖未形成,所以不能采用该治疗方法进行治疗,转而采用活髓切断术或血运重建术治疗该类疾病;经根管治疗后,成熟恒牙也存在牙齿折断和变色风险。针对以上问题,越来越多的学者将目光投向理想解决方案:牙髓再生。但是作为牙髓再生种子细胞的人牙髓干细胞(Human Dental Stem Cells,hDPCs)具有多向分化的潜能,故在牙髓再生中,其可能分化成不利的细胞类型。纳米材料可以通过改变材料刚度、表面微形貌等,模仿干细胞分化的不同微环境,进而调控干细胞定向分化。近年来,探索新型纳米材料调控牙髓干细胞向成牙本质细胞向分化成为研究热点。碳点作为是一种生物相容性好、成本低廉的纳米材料,自问世以来备受学者关注。本实验中,我们开发了一种二甲双胍碳点(Metformin Carbon Nanodots,MCD)并对其进行表征,进而研究其对hDPCs迁移作用和成牙本质向分化的影响,为MCD在牙髓再生中应用提供科学的理论依据。方法:1.MCD的合成:采用水热法,以二甲双胍和柠檬酸作为原料合成二甲双胍碳点。2.MCD的表征:通过透射电子显微镜(TEM)观察碳点的尺寸、形貌,傅立叶变换得到样品的红外光谱(FT-IR),荧光光谱仪扫描获取样品的荧光光谱。3.MCD的细胞生物相容性检测:将hDPCs与梯度浓度MCD(0、50、100、200、400、800μg/mL)培养液共培养。通过MTT法检测细胞活性,并通过流式细胞技术检测细胞凋亡。4.MCD促进牙髓干细胞向成牙本质向分化:将hDPCs与梯度浓度MCD(0、50、100、200μg/mL)培养液共培养,在7天、14天时,采用qRT-PCR技术检测成牙本质相关基因的表达,并在14天时以免疫印迹法(Western Bolt,WB)检测成牙本质相关蛋白的表达。5.MCD通过自噬促进hDPCs向成牙本质细胞分化:将hDPCs与MCD(50μg/mL)培养液分别共培养0、6、12、24、48、72h后,通过WB和透射电镜检测自噬情况;采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤预处理后,将hDPCs与浓度碳点(50μg/mL)培养基液共培养3天,检测自噬相关蛋白的表达和成牙本质相关基因的表达。6.MCD促进hDPCs迁移:将hDPCs接种于Trans-well的上室,下室内放入梯度浓度碳点(0、25、50、100μg/mL)无血清培养液共培养48 h,通过结晶紫染色和DAPI染色确定细胞的迁移数量。结果:1.TEM结果表明成功合成直径为5.9 nm的MCD,FT-IR结果表明碳点主要存在羟基、氨基等官能团。MCD为蓝色荧光材料,发射光谱中最佳激发波长为367nm,最佳发射波长为444 nm。2.MTT结果显示MCD浓度低于在200μg/mL时,不影响细胞活性;流式检测凋亡实验显示MCD浓度在200μg/mL以下时,不引起细胞凋亡。3.7和14天时的成牙本质相关的基因DSPP和DMP1等表达显著增高,14天时成牙本质相关DSPP和DMP1的蛋白表达也有增高。4.MCD促进自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin1的表达,即促进细胞自噬。通过透射电镜观察发现经MCD处理的hDPCs中有自噬体产生。自噬抑制剂预处理细胞后,显著降低了成牙本质相关基因和自噬相关蛋白的表达。5.MCD可促进hDPCs迁移,且在碳点浓度为50μg/mL时,迁移作用最强。结论:1.MCD的平均粒径为5.9 nm,是一种具有激发波长依赖特性的球形碳纳米颗粒。2.MCD的生物相容性良好。3.MCD可通过自噬促进hDPCs向成牙本质细胞分化。4.MCD可以促进hDPCs的迁移。