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肾脏是最容易老化的器官之一。肾脏在衰老过程中会发生一系列结构病变,异常的纤维形成损害肾脏结构和功能的平衡,导致终末期肾脏疾病的发生,最终导致肾功能衰竭而危害健康。然而,衰老相关肾损害的确切机制仍不清楚。氧化应激和炎症在衰老相关疾病的病因学中起着关键作用。本研究探讨了NADPH氧化酶4(NOX4)和核苷酸结合寡聚域内含蛋白(NOD)样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体在衰老相关肾损伤中的影响及其机制。人参皂苷Rg1具有广泛的抗衰老作用。本课题旨在研究NOX4-NLRP3信号通路在小鼠肾脏老化损伤中的作用及人参皂苷Rg1的调节作用。第一部分:NADPH氧化酶和NLRP3炎症小体激活在自然衰老小鼠肾脏衰老纤维化中的作用目的:研究NOX4和NLRP3炎症小体激活在自然衰老小鼠肾老化过程中的作用,探索抗肾老化纤维化的可能时间点和作用靶点。方法:6月龄昆明种小鼠(雄性),随机分组后正常饲养至16月龄,20月龄,24月龄,以6月龄为年轻对照组。血清中血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)检测自然衰老小鼠肾功能的变化;衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测自然衰老小鼠肾组织衰老情况;HE,PAS染色检测自然衰老小鼠肾组织形态学变化;Masson,IHC染色(胶原IV)检测自然衰老小鼠肾组织胶原纤维变化;DHE染色检测自然衰老小鼠肾组织中ROS的表达情况;Western Blot检测自然衰老小鼠肾组织NOX4,p22phox,p47phox的表达情况;Western Blot检测自然衰老小鼠肾组织NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β的表达情况;IHC染色检测自然衰老小鼠肾组织NLRP3的定位表达。结果:血清指标检测结果显示,6月龄对照组小鼠血清SCr和BUN水平表达较低,16月龄小鼠血清SCr和BUN水平明显升高,20和24月龄小鼠血清SCr和BUN水平出现非常明显的升高。β-半乳糖苷酶检测结果显示,6月龄对照组表达较少,16月龄表达增多,20和24月龄表达明显增多。HE,PAS染色结果显示,6月龄对照组小鼠肾脏无异常病理变化,肾小球形态规则,结构清楚,系膜细胞及其间质正常,肾小球未见系膜增生,肾小管完整、清晰;16月龄小鼠肾小球出现系膜增生,肾小球体积增大,而肾小管未出现明显病理损伤;20月龄小鼠肾小球和肾小管均出现比较明显的病理损伤;24月龄小鼠肾小球和肾小管出现非常明显的病理损伤。Masson,IHC(胶原IV)染色结果显示,6月龄对照组小鼠肾组织无明显的胶原生成;16月龄小鼠肾小球出现明显的胶原沉积,但肾小管间质与6月龄比较只有少许胶原生成;20月龄小鼠肾小球及肾小管均出现明显的胶原沉积;24月龄小鼠肾小球及肾小管均出现非常明显的胶原沉积。DHE染色结果显示,6月龄对照组小鼠肾组织ROS表达较少;16月龄小鼠肾组织ROS表达明显增多;20和24月龄小鼠肾组织ROS表达出现非常明显的增多。Western Blot结果显示,6月龄对照组小鼠肾组织NOX4,p22phox,p47phox的表达较少;16月龄小鼠肾组织p22phox,p47phox表达明显增加,NOX4表达有增加趋势但与6月龄比较无显著差异;20和24月龄小鼠肾组织NOX4,p22phox,p47phox表达明显增加。Western Blot结果显示,6月龄对照组小鼠肾组织NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β表达较低;16月龄小鼠肾组织NLRP3,caspase-1,IL-1β表达明显增加,ASC表达与6月龄比较有增加趋势但无显著差异;20和24月龄组小鼠肾组织NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β表达明显增加。IHC(NLRP3)染色结果显示,6月龄对照组小鼠肾组织NLRP3表达很少;16月龄小鼠肾小球中NLRP3表达增多;20月龄小鼠肾小球和肾小管间质中NLRP3表达出现明显增多;24月龄小鼠肾小球和肾小管间质中NLRP3表达出现非常明显的增多。第二部分:人参皂苷Rg1对SAMP8快速老化小鼠肾脏衰老纤维化的保护作用目的:本研究旨在研究Rg1对SAMP8快速老化小鼠肾衰老纤维化的保护作用及对NOX4-NLRP3信号通路的影响。方法:雄性6月龄SAMP8小鼠与SAMR1小鼠。将小鼠随机分为6组:(1)SAMR1对照组;(2)SAMP8模型组;(3)SAMP8+Tempol(50mg/kg)组;(4)SAMP8+Apocynin(50mg/kg)组;(5)SAMP8+Rg1(5mg/kg)组;(6)SAMP8+Rg1(10mg/kg)组。以Tempol,Apocynin,Rg1为给药组,连续灌胃给药9周(0.1 ml/10g/day),同时灌胃给予对照组和模型组等量蒸馏水9周。血清中BUN,Scr检测小鼠肾功能的变化;衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测小鼠肾组织衰老情况;HE,PAS染色检测小鼠肾组织形态学变化;Masson,IHC染色(胶原IV)检测小鼠肾组织胶原纤维变化;DHE染色检测小鼠肾组织中ROS的表达情况;Western Blot检测小鼠肾组织NOX4,p22phox,p47phox的表达情况;Western Blot检测小鼠肾组织NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β的表达情况;IHC染色检测小鼠肾组织NLRP3的定位表达。结果:血清指标检测结果显示,与对照组小鼠比较,SAMP8模型组小鼠血清BUN和SCr水平明显升高;与模型组比较,Tempol,Apocynin和Rg1(5,10 mg/kg)处理均明显降低小鼠血清BUN和SCr水平。β-半乳糖苷酶染色结果显示,与对照组比较,SAMP8模型组小鼠肾组织β-半乳糖苷酶的表达显著增加;与模型组比较,Tempol,Apocynin和Rg1(5,10 mg/kg)组小鼠肾组织β-半乳糖苷酶的表达均显著减少。HE,PAS染色结果显示,与对照组比较,SAMP8模型组小鼠肾脏出现非常明显的病理损伤,肾小球基底膜明显增厚,系膜明显增生,肾小球体积显著增大,肾小管结构明显紊乱,肾小管上皮细胞扁平脱落呈空泡样病变;与模型组比较,Tempol,Apocynin和Rg1(5,10 mg/kg)组均明显改善SAMP8小鼠肾脏损伤。Masson,IHC(胶原IV)染色结果显示,与对照组比较,SAMP8模型组小鼠肾小球及肾小管间质出现非常明显的胶原沉积;与模型组比较,Tempol,Apocynin和Rg1(5,10mg/kg)组处理均明显减轻肾组织胶原的沉积。DHE染色结果显示,与对照组比较,SAMP8模型组小鼠肾组织ROS表达出现非常明显的增多;与模型组比较,Tempol,Apocynin和Rg1(5,10 mg/kg)组小鼠肾组织ROS的表达均明显降低。Western Blot结果显示,与对照组比较,SAMP8模型组小鼠肾组织NOX4,p22phox,p47phox表达明显增加;与模型组比较,Rg1(10 mg/kg)处理显著降低了肾组织NOX4,p22phox和p47phox的表达,Rg1(5 mg/kg)和Apocynin可降低NOX4和p22phox的表达,但对p47phox表达无显著影响,Tempol处理可降低NOX4的表达,对p22phox和p47phox表达无显著影响。Western Blot结果显示,与对照组比较,SAMP8模型组小鼠肾组织NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β表达明显增加;与模型组比较,Rg1(5,10 mg/kg)处理显著降低SAMP8小鼠肾组织NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β的表达,Tempol和Apocynin处理可以明显降低NLRP3,caspase-1,IL-1β的表达,对ASC表达有降低趋势但无明显影响。IHC(NLRP3)染色结果显示,与对照组比较,SAMP8模型组小鼠肾小球和肾小管NLRP3的表达均显著升高;与模型组比较,Tempol和Apocynin处理可降低SAMP8小鼠肾小球和肾小管NLRP3的表达,尤其是肾小球,Rg1(5,10 mg/kg)可显著下调SAMP8小鼠肾小球和肾小管NLRP3的表达。结论:实验结果表明小鼠在自然衰老过程中伴有明显的衰老相关性肾损伤和纤维化。NOX4和NLRP3炎症小体在肾脏衰老过程中被显著激活,特别是在20和24月龄小鼠中。NOX4介导的过量ROS的生成在肾组织NLRP3炎症小体的激活中起重要作用。NOX4-NLRP3信号通路与自然衰老小鼠肾损伤和纤维化密切相关。NOX4-NLRP3炎症小体信号通路可能是预防衰老相关肾损伤的重要靶点,16-20月龄可能是预防小鼠衰老相关肾损伤的重要时期。人参皂苷Rg1可以改善SAMP8小鼠肾脏衰老相关性肾损伤和纤维化。Rg1具有明显的抗氧化作用,降低了肾组织NOX4的表达。此外,Rg1显著抑制SAMP8小鼠肾组织NLRP3炎症小体的激活。结果表明Rg1可通过抑制NOX4介导的ROS氧化应激和NLRP3炎症小体激活来延缓肾脏衰老,减轻与衰老相关的肾损伤和纤维化。