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每年,我国水产加工行业产出的罗非鱼下脚料数量巨大。罗非鱼下脚料中营养物质多样,富含蛋白质,是优质高效的动物蛋白质源。但是目前对罗非鱼下脚料的利用还处在落后阶段,只有少部分被加工成鱼粉等低值产品,大部分被丢弃,造成了资源浪费的同时且加剧了对自然环境的污染。如何将这些宝贵的资源高值化利用起来,成为世界科学工作者们研究热点。近年来,随着对饲用活性肽的深入研究,其越来越多的生理功能被发掘出来,显示出巨大的潜力和广阔的应用前景。抗菌脂肽和营养小肽作为饲用活性肽的重要成员,被认为是目前最具潜力的饲用抗生素替代品。但由于生产工艺复杂,产品成本高,污染排放大,产业化进展缓慢。若能将两者生产工艺合二为一,可以简化工艺,大幅度降低成本,且能实现生产零排放,从而突破高效产业化生产技术瓶颈。针对以上存在的问题,本文拟利用罗非鱼下脚料作为主要的营养基质,加入一定量的麸皮和甘蔗渣作为通气的物质,接入纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6,进行固态发酵生产同时含脂肽和小肽的复合型活性肽饲料,优化了发酵条件和发酵基质,最大化抗菌脂肽的产量,探究了整个发酵过程中各参数指标的动态变化并以此为依据建立发酵动力学模型,接着对基质进行二次酶解并对酶解条件进行优化制得活性多肽,将酶解得到的多肽分离纯化,找出其中的活性肽并对其进行质谱检测,进而确定活性小肽的分子量及氨基酸序列,最后检测发酵终产物的各参数指标,评估产品品质。本研究内容及结果如下:1.探究了罗非鱼下脚料与麸皮的配比、甘蔗渣添加量、初始基质水分含量、初始pH、接种体积、发酵温度及时间这七个因素对抗菌脂肽产量的影响,利用LC-MS法定量检测抗菌脂肽的产量,在单因素实验的基础上通过响应面设计进一步优化,得到最佳的发酵工艺参数,结果表明:罗非鱼下脚料与麸皮配比3.48:1,时间61.69h,初始基质水分含量69.34%,温度28.97℃时,抗菌脂肽产量最高,达7.32g/kg。通过此优化,抗菌脂肽的产量得到了明显提高。2.监测了整个发酵过程的各理化指标(pH、温度、水分)、抗菌脂肽含量、蛋白水解度、蛋白含量、菌体生长及酶活力等的动态变化,通过Origin软件对纳豆菌生长、蛋白消耗及脂肽生成的实验数据进行拟合,并以此为依据建立相应的发酵动力学模型,结果表明,得到的拟合方程R2均在0.98以上,拟合效果良好,此研究为我们将此工艺扩大化应用到实际生产中提供理论依据。3.对发酵基质进行二次酶解,以水解度为衡量指标,探究温度、时间、pH及水料比对内源酶酶解蛋白程度的影响,单因素实验表明以上四种因素对水解度均有显著的影响,在此基础上采用响应面设计优化得到最佳的酶解工艺:温度48.56℃,pH7.43,水料比1.07:1,时间8.29h,水解度达最大为37.56%,从而实现活性小肽产率最大化。4.本试验对发酵酶解终产物中的有效成分进行了全面分析,包括营养小肽、抗菌脂肽和其他技术指标的测定。一方面利用超滤技术分离罗非鱼下脚料蛋白酶解液得到产物多肽液,分别检测各组分的自由基清除活性,其中以1000Da以下活性最高(56.85%),再将这一组分通过SephadexG-25凝胶色谱技术进一步分离纯化,得到5个洗脱峰,分别为TPH-1、TPH-2、TPH-3、TPH-4和TPH-5,其中以TPH-4活性最强(70.58%),后通过LC-MS/MS法测定TPH-4,最终确定TPH-4含有两种小肽,分子量分别为566.47和679.52,经分析其对应的氨基酸序列分别为Leu-Asn-Asp和Leu-Met-Leu-Leu;另一方面利用LC-MS法检测分析干燥终产物中抗菌脂肽的组成成分及含量,结果表明终产物中的抗菌脂肽主要含Surfactin(995.20,1008.20,1058.20)和Iturin(1044.30,1071.20)两类,另外还有很少量的Fengycin(1493.00),含量达6.93g/kg;此外还测得终产物复合饲料中粗蛋白含量达32.13g/100g(干重),寡肽含量为12.09%,水解度达37.32%,益生菌纳豆菌数量为9.0×108cfu/g(干重),发酵前后蛋白质体外消化率、蛋白溶解度及必须氨基酸的含量均明显升高,产品品质得到显著提升。其中既富有抗菌脂肽,又含有活性小肽,有希望成为优质的饲料添加剂应用到生产中。