精密的嗅觉系统是昆虫生存和繁殖的重要保障,通过嗅觉昆虫可以精准地感受环境中其它动植物释放的各种化学气味,做出相应的行为和生理反应,如觅食、交配、躲避天敌等。昆虫的嗅觉涉及多种蛋白,主要有气味结合蛋白(odorant-binding protein,OBP)、气味受体(odorant receptor,OR)、感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)、离子型受体(ionotropic receptor,IR)和气味降解酶(odorant degrading enzyme,ODE),并主要由以下几个步骤组成:1)外界脂溶性气味分子穿过嗅觉感器表面的微孔进入触角淋巴液并与OBP结合,形成气味分子/OBP复合物;2)复合物穿过水溶性的触角淋巴液到达嗅觉神经元的树突表面,气味分子从复合物脱离激活树突膜上的OR;3)OR的激活改变神经元细胞膜的通透性,产生动作电位,信号被进一步传递到中枢神经系统;4)在完成信号转导后,气味分子被ODE降解,从而恢复嗅觉神经元的敏感性。另外,化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)被认为具有和OBP相似的功能,在溶解和转运脂溶性气味分子中起作用。近年来,有关嗅觉基因及其功能的研究成为热点,但针对双翅目、鳞翅目及鞘翅目等昆虫的研究多,对其它目昆虫的研究很少;针对害虫类群的研究多,对天敌昆虫的研究很少。脉翅目中大部分种类是天敌昆虫,其中大草蛉(Chrysopa pallens Rambur)和中华通草蛉(Chrysoperla sinica Tjeder)可以捕食多种农业害虫,如:蚜虫、蚧壳虫、蓟马及鳞翅目害虫的卵和低龄幼虫等,并且适应多种类型的农业生态系统,是生物防治的重要种类,但有关脉翅目昆虫嗅觉机制的研究尚属空白。棉铃虫(Helicoverpa armigeraHubner)是多食性重要害虫,主要危害棉花、玉米及多种蔬菜。转Bt基因抗虫棉虽然有效降低了棉铃虫的危害,但害虫对Bt毒素的抗性问题逐渐显现,仍需要开发有效的替代防治技术。研究“植物-害虫-天敌”间的气味联系及其机制,不仅能为开发高效的害虫和天敌引诱剂或驱避剂应用于害虫的“Push-Pull”防治提供基础,同时也可深入探讨植物与害虫及害虫与天敌间的识别机制。本文以棉花-棉铃虫-大草蛉和中华通草蛉为系统,重点就棉铃虫及其两种草蛉的嗅觉相关基因进行分子鉴定和功能分析,主要结果如下:1.大草蛉嗅觉相关基因的鉴定、组织表达谱及数字基因表达谱分析为了高效获得大草蛉嗅觉相关基因,对大草蛉进行了转录组测序,共鉴定出16个CpalOBP、17个CpalCSP和39个CpalOR基因。选一步对上述CpalOBP、CpalCSP和CpalOR基因进行组织表达谱研究表明,大部分CpalOBP和全部CpalOR基因在触角中高表达或特异表达,而CpalCSP具有更为宽泛的表达谱。另外,通过构建并分析雌雄虫10个不同组织的数字基因表达谱文库发现,大部分嗅觉相关基因在雌雄虫触角中上调;在雌雄虫间,胸部和腹部基因的表达差异最大,以雌虫胸部和腹部上调的基因数目最多,并且大多为代谢相关基因。研究结果为探索大草蛉的化学感受机制提供了重要基础。2.中华通草蛉嗅觉相关基因的鉴定和组织表达谱分析中华通草蛉是棉铃虫的又一种重要天敌,本研究对其雌雄虫触角分别进行了转录组测序,共鉴定得到12个CsinOBP基因、19个CsinCSP基因和37个CsinOR基因。进一步的组织表达谱分析显示,与大草蛉的结果类似,大部分CsinOBP基因在触角中高表达或特异表达,因此推测这些基因在嗅觉中扮演了重要角色。CsinCSP基因表现出宽泛的组织表达谱,其中CsinCSP4、6、14和16为触角高表达,因此可能参与中华通草蛉的化学感受过程;其它CsinCSP则可能具有(或同时具有)嗅觉以外的作用。CsinOR基因均表现为触角高表达或特异表达,与OR在嗅觉中的重要功能一致;在所有的CsinOR中CsinORco的表达量最高,与ORco作为所有OR的辅助受体的功能也是一致的。3.大草蛉与中华通草蛉嗅觉相关基因的比较分析大草蛉和中华通草蛉的幼虫食性相同,均取食蚜虫,但成虫食性完全不同,大草蛉成虫主要以蚜虫等昆虫为食,中华通草蛉成虫则主要以花粉、花蜜、蜜露为食。为了探究两种草蛉嗅觉基因与食性的关系,将CSP、OBP和OR基因的组织表达谱、系统发育和mRNA丰度在两种草蛉间进行了比较分析。结果表明,OBP、CSP和OR基因在大草蛉和中华通草蛉进化过程中共发生了12次gain和17次loss事件,说明嗅觉基因间的差异与两种草蛉食性的分化有一定的联系;大草蛉CpalOBP和CpalOR基因的总表达丰度分别为20718和334,小于中华通草蛉33662和444,并且CpalORco的表达丰度比CsinORco低580倍,暗示两种草蛉的嗅觉模式可能存在差异。4.大草蛉气味结合蛋白的功能研究采用原核表达技术成功表达并纯化了9个CpalOBP,并通过荧光竞争结合试验对这9个CpalOBP与85种气味物质的结合能力进行研究。结果显示,CpalOBP与32种植物气味、害虫诱导挥发物及法尼烯有很强的结合能力(Ki<20μM),推测其在大草蛉寻找栖息地和产卵场所,以及依据虫害诱导的植物挥发物寻找并捕食蚜虫的过程中发挥作用;不同CpalOBP的气味结合谱不同但具有一定的重叠,由此可以增加大草蛉嗅觉的气味谱及其灵敏性。根据荧光竞争结合试验结果,进一步进行“Y”形管趋避活性测定,发现己酸叶醇酯、癸醛、蒎烯和2-己基-1-癸醇4种气味对大草蛉具有显著的引诱活性,而14种气味物质(丁酸反-2-己烯酯、2-十五烷酮、十二烷、十一烷、乙酸壬酯、丁酸顺-3-己烯酯、十三烷、十四烷、香叶丙基酮、2-十三烷酮、十一醛、辛醛、法尼醇和法尼烯)表现出显著的驱避活性。鉴于法尼烯是蚜虫的报警信息素,推测大草蛉能够通过识别进而避开法尼烯存在的区域以提高对蚜虫的搜寻效率。CpalOBP功能研究及生物活性气味物质的筛选,为害虫的“push-pull”策略的开发和应用提供了重要支撑。5.中华通草蛉气味结合蛋白的功能研究采用原核表达技术成功表达并纯化了6个中华通草蛉CsinOBP,并通过荧光竞争结合试验对这6个CsinOBP与85种气味物质的结合能力进行测定。结果显示,不同CsinOBP的气味结合谱不同,CsinOBP4与所测气味物质均无明显的结合能力;CsinOBP2、6和9的结合谱极窄,仅分别结合1种气味物质(Ki<20μM);CsinOBP1的结合谱相对较宽,与8种气味物质有较高的结合能力(Ki<20μM);CsinOBP10的结合谱最广,可以结合21种气味物质(Ki<20μM)。由于CsinOBP1与水稻和大豆的挥发物十二烷、2-己基-1-癸醇、β-石竹烯和反式石竹烯以及蚜虫报警信息素法尼烯等有着极强的结合能力,推测其在中华通草蛉寻找猎物寄主植物、栖息地和产卵场所以及捕食蚜虫过程中发挥作用。与CpalOBP10有较强结合能力的21种气味物质中有多种植物挥发物及棉花的诱导挥发物苯乙醛和丁酸叶醇酯,因此CsinOBP 10可能在中华通草蛉通过诱导的植物挥发物来搜寻猎物昆虫的过程中发挥的作用。6.棉铃虫气味结合蛋白的分子鉴定及功能研究通过构建cDNA文库,首次从棉铃虫中鉴定得到两个Minus-C OBP基因(HarmOBP17和18)。qPCR结果显示,HarmOBP17在低龄幼虫和成虫中高表达,而HarmOBP18只在成虫期高表达;HarmOBP17主要在雌雄虫触角和雌虫头部高表达,而HarmOBP18只在雌虫翅中高表达。采用荧光竞争结合试验对2个OBP与85种气味物质在不同pH下的结合能力进行测定,结果表明2个蛋白均与β-紫罗兰酮的结合能力最强(Ki<13μM)。令人意外的是,2个OBP与气味物质在pH=5.0的条件下的结合能力比pH为7.4和10.0时强,暗示着在HarmOBP17和18中可能存在另外一种不同的配基释放机制。另外,对HarmOBP17和18进行了C-末端突变,试验说明C-末端在HarmOBP17和18结合和释放配基的过程中发挥了重要作用。7.棉铃虫化学感受蛋白的分子鉴定及功能研究通过棉铃虫转录组测序和构建cDNA文库,共鉴定得到棉铃虫24个HarmCSP基因,并对它们的组织表达谱和生理功能进行了研究。qPCR结果表明,HarmCSP基因表现出不同组织表达谱,暗示不同HarmCSP具有不同的生理功能。其中,HarmCSP6、9、18和19主要在嗅觉组织或性腺中表达,因此采用原核表达和荧光竞争结合试验,对它们的功能进行了分析。结果显示4个HarmCSP对85种所测气味物质均无结合能力,但是HarmOBP6与棉铃虫性信息素组分及前体有很强的结合能力(Ki<1.5μM),说明HarmCSP6可能具有识别棉铃虫性信息素组分的功能。进一步对HarmCSP6在成虫触角中的感器分布进行了定位,发现HarmCSP6在雌雄虫触角的长毛型感器下的细胞中表达,支持了HarmCSP6参与感受棉铃虫性信息素功能的推测。综上所述,本文从大草蛉、中华通草蛉和棉铃虫中鉴定得到了大量的嗅觉相关基因,同时采用系统发育分析、mRNA丰度分析、半定量分析、荧光定量分析、配基结合分析、行为活性分析以及原位杂交等技术对3种昆虫的嗅觉基因进行了功能研究,并筛选出18种对大草蛉具有生物活性的气味物质。研究结果为阐明3种昆虫的嗅觉机制提供了重要依据,CpalOBP功能研究及生物活性气味物质的筛选为“push-pull”策略在棉田等农业生态系统中的开发和应用提供了基础。