亮氨酸脱氢酶是一种依赖辅酶NAD⁺的氧化还原酶,它可逆地催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物。本论文所研究的亮氨酸脱氢酶主要用于催化丁酮酸合成L-2-氨基丁酸。L-2-氨基丁酸是一种非常重要的医药中间体,被广泛的用于合成抗癫痫药物布瓦西坦、左乙拉西坦和抗结核药物盐酸乙胺丁醇。本课题所使用的产亮氨酸脱氢酶的菌株是实验室保藏的基因工程菌,为了更快的筛选出活力高的突变菌株,首先建立一个基于钙黄绿素-铜的高通量筛选模型并对其参数进行了优化。结果表明最适的底物体系为:1mL反应体系中含0.01g丁酮酸,0.07g NADH,10μL氨水;体系中钙黄绿素浓度为1.0×10^-5 mol/L,铜离子浓度为1.5×10^-4mol/L,pH为7.5,反应的稳定时间为20分钟;最佳的激发波长和发射波长,分别为490nm和520nm;以该方法测得产物标准曲线线性良好,结果与氨基酸分析仪测得数据吻合。通过expasy和npsa-prabi在线网站对亮氨酸脱氢酶的各种性质进行分析,发现其分子量为40571.3Da,由367个氨基酸残基组成,计算得理论等电点为5.56,不稳定指数（II）计算值为32.01,脂肪指数为84.55,亲水性平均系数为-0.304,二级结构中α螺旋结构较多。再运用在线的Swiss-Model软件进行同源建模,得到三个模型,再运用在线模型评估软件services对3个模型分别进行评估,发现模型一打分最高,选用模型一与丁酮酸进行分子对接,得到的合理构象在PYMOL上进行分析选点,再结合文献中报道的机理研究,选择Leu41、Gly43、Arg61、Met66、Asn70、Asn262、Met347、Gln358这8个位点进行饱和突变。最终只得到M347G、M347N、Q358T、Q358N、N70F、M347G/Q358T这7个活力提高的菌株。选择M347G、Q358T、M347G/Q358T这三个突变酶和原始酶进行酶学性质的研究。突变体M347G、Q358T和突变体M347G/Q358T的比酶活,分别是原始酶酶活的3.41、4.59和4.00倍。酶促反应动力学研究结果表明,突变体的K_m都比原始酶的低,k_cat和k_cat/K_m值都大于原始酶。原始酶最适反应温度为35?C,而突变体M347G/Q358T在30、35、40?C时的酶活相差不大。突变体的热稳定性好于原始酶,且都在40?C保存条件下稳定性最好。反应的最适pH都为9.0,且亮氨酸脱氢酶在弱碱性环境下的稳定性较好。金属离子和表面活性剂对突变前后的亮氨酸脱氢酶酶活的影响不大。