论文部分内容阅读
核呼吸因子(nuclear respiratory factor, NRF),包括NRF-1和NRF-2,是调控线粒体DNA复制、保证线粒体功能完整和细胞正常生长发育的重要转录因子,我们以往的结果显示,正常细胞中NRF-1和NRF-2的转录水平与细胞的能量代谢密切偶联,呈正相关关系。然而肿瘤细胞能量代谢特点为有氧氧化能力显著下降、糖酵解能力显著增强,肿瘤细胞中是否存在NRF对线粒体呼吸链转录调节方面的障碍还未见报道。为阐明NRF-2在肿瘤中的功能和作用机制,本课题对人NRF-2的α、β亚基蛋白进行了原核表达并成功制备兔抗人NRF-2α、NRF-2β多克隆抗体和鼠抗人NRF-2α单克隆抗体,用免疫组化的方法研究NRF-2α在肿瘤组织中的分布特点;并采用脂质体介导基因转染和G418筛选,获得能稳定表达外源性NRF-2α蛋白的宫颈癌细胞系(HeLa-EGFP-NRF-2α)。通过RT-PCR、Western blot检测NRF-2α及其共激活物——过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1, PGC-1)、下游靶基因线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A ,mtTFA)及线粒体呼吸链关键酶细胞色素氧化酶(Cytochrome C oxidase,COX)等的变化情况;应用Mito Tracker染色、组织化学染色、图像分析、ATP定量检测观察上调NRF-2α表达对肿瘤细胞线粒体结构与功能的影响;通过MTT、生长曲线、流式细胞术、TUNEL和Hoechst染色等,并建立裸鼠体内移植瘤模型来观察上调NRF-2α表达对肿瘤细胞增殖、凋亡以及对化疗药物敏感性的影响。实验结果显示:1)成功制备兔抗人NRF-2α、NRF-2β多克隆抗体和鼠抗人NRF-2α单克隆抗体,免疫组化检测到肝细胞癌、宫颈浸润性鳞状细胞癌和上皮内瘤变组织中NRF-2α低表达。2)成功获得了能稳定表达外源性NRF-2α蛋白并发挥其转录活性功能的宫颈癌细胞系,命名为HeLa-EGFP-NRF-2α。3)HeLa-EGFP-NRF-2α细胞中NRF-2α的共激活物PGC-1、靶基因TFAM及线粒体呼吸链蛋白COX亚基、细胞色素C(cytochrome C, Cyt C)的表达上调;mtDNA拷贝数增加;线粒体膜电位升高;电镜观察示线粒体基质密度增高;细胞内ATP浓度上升。4)HeLa-EGFP-NRF-2α细胞出现G1期阻滞,细胞生长速度减慢。5)给与化疗药物顺铂作用后,HeLa-EGFP-NRF-2α细胞生存率显著降低、凋亡指数显著高于对照组,细胞内Cyt C、Bcl-2相关蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)等基因的转录显著增多。6)裸鼠体内移植瘤实验发现:经顺铂治疗后,HeLa-EGFP-NRF-2α组肿瘤体积显著缩小,抑瘤率显著高于对照组,瘤组织中Cyt C、Bax表达显著增多,COX活性增强。综合上述实验结果,我们的研究首次用免疫组化的方法发现宫颈浸润性鳞状细胞癌、上皮内瘤变和肝细胞癌组织中NRF-2α低表达,揭示上述肿瘤中存在NRF-2对线粒体呼吸链基因转录调节方面的障碍;证实上调NRF-2α表达抑制Skp2基因转录,使HeLa细胞发生G1期阻滞,细胞增殖活性减弱;体内、体外实验证实上调NRF-2α表达从转录调节途径提高了线粒体呼吸链蛋白表达和氧化磷酸化水平,促进了HeLa细胞及裸鼠体内移植瘤对化疗药物诱导的凋亡的敏感性。为以NRF-2作为新的肿瘤基因治疗靶点的研究提供了实验基础。