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水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起的条纹叶枯病是我国粳稻产区的一种毁灭性病毒病害。RSV是由半翅目昆虫灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久增殖型方式传播,并可经卵传递给后代,但是不经精子传播。RSV在灰飞虱体内需要突破肠道侵入和释放屏障、唾液腺侵入和释放屏障以及入卵传播屏障才能完成传播过程,而且还要进行病毒的复制。这种复杂的传播和复制过程导致携带 RSV的灰飞虱产卵量降低、孵化历期延长、孵化率和羽化率降低、卵发育迟缓或畸形、带毒若虫成活率降低、五龄和整个若虫阶段的发育历期缩短等。 为了探究 RSV对灰飞虱生长发育影响的分子机理,更好地揭示 RSV与灰飞虱的互作关系,本文利用 iTRAQ技术分析比较了灰飞虱成熟卵细胞经 RSV侵染前后的蛋白质组差异,并进一步利用 RT-qPCR对得到的部分差异蛋白质进行了验证,分析差异蛋白质在转录水平上的变化。结果显示灰飞虱成熟卵细胞受 RSV侵染后有147种蛋白质表达差异明显,其中98种蛋白质显著上调表达,59种蛋白质显著下调表达,这些蛋白质主要参与翻译、代谢、电子传递、细胞周期、运输、转录调控等生物学过程。通过 RT-qPCR验证的12种差异蛋白质在转录水平上的变化趋势与 iTRAQ的结果一致。其中与减数分裂相关蛋白质(丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2B和细胞周期素 B3)和有丝分裂相关蛋白质(细胞周期素 B3和动力蛋白)在带毒卵内差异表达可能会影响卵细胞成熟分裂和卵裂的完成,导致后续胚胎发育异常、延迟甚至死亡,进而导致孵化率降低。参与到呼吸链和营养代谢的蛋白质在带毒卵内表达发生很大变化,可能导致 ATP和营养物质供应不足,进而影响受精和胚胎发育。 此外,为了解 RSV对灰飞虱若虫生长发育的影响,检测了灰飞虱若虫生长发育相关基因在RSV侵染前后转录水平的差异。将灰飞虱转录组拼接后建立本地数据库,根据黑腹果蝇生长发育基因序列比对得到10种灰飞虱同源基因序列,设计特异引物,通过 RT-qPCR方法检测了带毒灰飞虱和无毒灰飞虱体内这10种生长发育相关基因转录水平的差异。结果显示,这些基因在RSV的影响下转录均发生变化,8种基因的转录发生显著变化,其中2种转录被激活,6种受到抑制。动力蛋白和钠钾转移 ATP酶转录水平的变化可能影响灰飞虱神经系统发育,造成昆虫行为异常;桩蛋白转录下降会影响昆虫翅的发育;与细胞骨架相关的5种基因转录也受到了抑制,可能降低昆虫骨架的坚硬度,影响羽化的完成。 本实验分别利用了 iTRAQ和 RT-qPCR技术从分子层面解释了 RSV对灰飞虱生长发育的影响,对生长发育基因翻译和转录水平的初步探究为更好的理解RSV与灰飞虱的互作奠定了基础。