热带假丝酵母高产核糖核酸的连续发酵及提取纯化工艺研究

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核糖核酸(RNA)是一类十分重要的生物大分子,在基因的表达和蛋白质的生物合成起着关键的作用。随着研究水平的提高,核糖核酸在医药、保健品和食品加工等方面的应用越来越广泛。微生物体内含有丰富的RNA,因此利用培养富含核糖核酸的酵母来发酵生产核糖核酸是目前工业化生产的主要工艺,应用于工业化生产RNA的菌种主要酿酒酵母和热带假丝酵母。日本制纸株式会社利用亚硫酸纸浆为培养基通过鼓泡式发酵罐培养酵母,目前年生产能为480吨;有资料报道,我国福建珍奥核酸有限公司(原福建莆田糖厂)以甘蔗糖蜜为碳源采用气升式发酵罐培养高核酵母,发酵液稀释率维持在0.66h-1左右,酵母干菌浓度可以达到11~12g/L, RNA含量达到14~15%,年产核糖核酸200吨,但与日本生产工艺仍存在较大的差距。因此目前迫切需要改变我国生产核糖核酸的工业现状,提高核糖核酸生产效率与质量,提高产品竞争力,缩短与世界先进生产工艺的差距。本论文将一株热带假丝酵母菌株(Candida tropicalis, CGMCC No.3558)活化后利用单因素正交试验对其培养基进行优化,利用优化的培养基培养酵母菌,菌体于菌浓度可达16~19g/L,核糖核酸含量可达12~14%。本论文进一步优化RNA生产工艺,利用200L搅拌发酵罐对热带假丝酵母进行发酵培养,研究了pH、溶氧、发酵温度和连续发酵不同稀释率等因素对热带假丝酵母生长代谢与RNA产量的影响。实验结果表明,此株高核酵母最佳培养的条件为pH4,溶氧率大于30%,培养温度32~33℃;在分批发酵中,培养基糖浓度为40g/L时,最高干菌浓度可达19.9g/L,RNA最高含量达到13%左右,糖转化率为48.5%;在分批发酵基础上种子扩大培养利用30M3机械搅拌罐通气以0.3~0.5h-1的稀释率进行连续发酵,核酸含量可达到12~14%,干菌浓度可达18~21.3g/L,糖转化率可达50%左右。最终实现了机械搅拌罐连续发酵热带假丝酵母工业化生产RNA的新工艺。此种工艺大幅度提高了单位体积和单位时间生产RNA的能力,提高了设备利用率,同时简化了工作程序,降低了劳动强度与生产成本,提高了生产效率本论文研究了NaOH浓度、抽提时间、抽提温度、酵母浓度各因素对核酸抽提率的影响,并确定了最佳抽提工艺参数,通过稀碱法对热带假丝酵母进行RNA提取。通过浓盐法与稀碱法的比较,认为通过稀碱法得到的RNA产品纯度高,环境污染小,适于工业化生产。
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