论文部分内容阅读
人感染乙型肝炎病毒(hepatitis b vius,HBV)后可导致急性自限性肝炎,或者转为慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)。尽管只有3～10％个体感染HBV后成为CHB患者,但据世界卫生组织统计全世界超过20亿人感染过HBV,CHB人口仍巨大。我国多年来一直是HBV感染的高流行区,全国约有1.2亿CHB患者。乙型肝炎慢性化的机制比较复杂,仍然有待进一步阐述。
HBV感染人体后,特异性T、B淋巴细胞可清除病毒。然而CHB患者在感染急性期HBV DNA水平较高,进入慢性期后HBV DNA水平维持在较低水平,免疫系统未能成功清除病毒,导致了HBV持续存在。目前较多的研究认为HBV结构基因选择性突变逃避宿主免疫监测,但HBV调控序列中增强子的变异对HBV基因组的转录与复制水平的下调作用导致感染慢性化的机制却较少报道。HBV基因组上有二个增强子序列。研究表明HBV增强子Ⅰ(enhancerⅠ,EnhⅠ)对HBV基因组的转录与复制起重要调控作用,其序列上的突变与HBV感染慢性化的相关性未见报道。
本研究拟选取CHB患者,采用PCR技术对HBV EnhⅠ区域DNA进行扩增并直接测序,采用Genotyping软件分析序列并鉴定其基因型(genotype),利用DNAMAN软件将获得的HBV序列与genebank上相应基因型HBV参考株序列比对以分析变异,同时检测血清中HBV DNA水平、免疫学指标HBsAg、HBeAg滴度,分析EnhⅠ基因变异与HBV DNA水平、HBsAg和HBeAg滴度的关联性,以分析EnhⅠ基因变异对乙肝慢性化的影响。
目的(1)比较Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix扩增HBV靶DNA保真度影响。(2)研究江西地区CHB患者体内HBV EnhⅠ区域基因变异。(3)研究CHB患者HBV EnhⅠ基因变异对血清HBV DNA水平及HBsAg、HBeAg滴度影响。
方法：(1)取CHB患者血清与阴性对照血清标本各一份,抽提血清中DNA,采用Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix分别扩增HBV DNAnt835-nt1396片段,PCR产物测序并DNAMAN软件进行比对。(2)收集来我院就诊的CHB患者70名,其中“大三阳”35例,“小三阳”35例,健康体检者2名血清,PCR扩增HBV EnhⅠ基因,产物测序后利用Genbank中Genotyping对HBV进行分型,利用DNAMAN软件与标准株比对分析DNA序列中的变异位点。荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)法定量检测血清HBV DNA拷贝数,倍比稀释血清后用ELISA法检测HBsAg、HBeAg滴度。采用SPSS13.0统计软件分析,HBV DNA拷贝数以其对数值计算(x)±S,滴度均值采用几何均数表示。阳性率比较采用x2检验,组间比较HBV DNA拷贝数阳性对数均值差异采用多应变量方差分析,两两比较均采用不假定方差相等Dunnett’s T3检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果：(1)二种PCR试剂均能特异地扩增出HBV靶基因片段,PCR产物测序比对结果显示,Taq PCR MasterMix扩增产物与Taq Plus PCR MasterMix扩增产物相比,产生了nt1390缺失和nt1389T→C及nt1392G→T二个突变位点。(2)70例乙肝患者HBV DNA测序后经Genotyping比对,均属于B型,与参考序列AF100309同源性最高,CHB患者HBV ErdaⅠ主要变异位点为:nt1010A→T,nt1013G→A,nt1031T→C,nt1034A→G,nt1053C→T,nt1082A→T,nt1133G→A,nt1167C→T,nt1223C→A,nt1227G→C,nt1230A→C,nt1241T→A,nt1244G→A,nt1246C→A,m1251C→G,m1289A→C,nt1349A→C。(4)CHB患者HBV EnhⅠ区域nt1133G→A变异对应的HBV DNA拷贝数与HBsAg、HBeAg滴度明显降低。
结论：(1)两种不同PCR试剂中Taq和Pfu混合DNA聚合酶的Taq Plus PCRMasterMix试剂催化PCR反应中HBV靶DNA片段扩增的保真度高于Taq DNA聚合酶。(2)江西地区乙肝患者感染HBV基因型主要为B型,HBV EnhⅠ区域nt1133G→A可降低EnhⅠ功能,下调HBV基因表达,ErdaⅠ区域基因变异可能是导致乙肝慢性化的因为之一。