研究背景:　　恶性肿瘤是危害人类生命健康的重大疾病之一，目前的主要治疗措施是手术结合化疗及放疗等，但治疗效果和预后都不理想。其中的一个重要原因在于肿瘤的转移增加了治疗的难度。化疗是恶性肿瘤重要的辅助治疗方式，尤其是对发生了远处转移的癌症。蒽环类化疗药物是最常用的化疗药物之一，而这类药物的最大副作用就是其剂量累积性心脏毒性，严重限制了其临床使用。为解决化疗所带来的副作用，提高药物的疗效，我们将纳米技术应用于肿瘤的靶向送药，并且结合纳米材料的光热效应，实现高效靶向性的协同治疗。　　我们构建的磁性复合纳米载体，主要由还原响应性两亲共聚物聚乙二醇聚酯胺(PEG-rPAE)和磁响应性超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)构成，再利用其包裹阿霉素构成DOX/rPEA@SPIONs，以充分发挥其多靶点抗肿瘤的能力，最终实现抑制肿瘤及转移。对DOX/rPEA@SPIONs的粒径分布、药物的体外释放行为等理化特性的表征结果显示，rPEA@SPIONs粒径为～200nm、分布均一。在模拟人生理环境条件下，DOX释放相当缓慢，但在10mM DTT存在的条件下，复合纳米药物发生快速降解，导致药物释放加快。空载体的近红外光热效应实验表明rPEA@SPIONs在808nm近红外光照射下具有良好的光热转换性能和光热稳定性，符合作为光热治疗剂的要求。　　然后我们在动物水平研究了DOX/rPEA@SPIONs的靶向性、抗肿瘤效应和副作用。结果表明，外加磁场可明显提高经系统给药的纳米复合物在肿瘤部位的积累。进一步热化疗抗肿瘤研究显示DOX/rPEA@SPIONs结合光热治疗展现了较好的协同治疗效应，使得荷瘤小鼠皮下肿瘤显著消退并且可以减少脏器毒性和远处转移。DOX/rPEA@SPIONs体内抑制肿瘤转移的研究结果表明复合纳米药物结合光热治疗可以显著延长转移癌小鼠的生存期，改善生存质量，减少转移。总之DOX/rPEA@SPIONs作为磁靶向性的光热化疗纳米载药系统，在肿瘤的临床治疗中的具有潜在的应用价值。　　目的:　　1.制备磁导向性、还原响应性、近红外感应性的纳米载药体系，并对纳米颗粒的形态、磁性和动态散射直径等进行表征，检测空载体对MB49细胞的毒性。　　2.利用808nm激光对不同浓度的rPEA@SPIONs溶液进行不同时间的照射，检测其光热转换性能和光热稳定性。　　3.利用MTT比色法检测纳米空载体在NIR照射下，对MB49细胞的光热毒性。　　4.利用小动物活体成像技术及普鲁士蓝染色，观察DOX/rPAE@SPIONs在外加磁场引导下的肿瘤靶向积累、器官分布。　　5.利用HPLC检测DOX/rPAE@SPIONs在静脉给药后，DOX在小鼠体内的血液循环和生物分布情况。　　6.通过建立小鼠MB49膀胱癌皮下肿瘤和肺转移癌模型，探讨DOX/rPAE@SPIONs在动物水平的抗肿瘤效果。　　7.通过观察小鼠活动状态、体重变化，检测血生化水平以及对重要脏器进行HE和普鲁士蓝染色，评价纳米颗粒在动物体内的毒副作用。　　方法:　　1.DOX/rPAE@SPIONs的合成:由北京中科院高能物理研究所制备并装载。　　2.利用透射电子显微镜、动态光散射仪和振动样品磁强计等设备对rPEA@SPIONs的大小、粒径分布、磁性等理化特性进行表征，MTT比色法检测rPEA@SPIONs对MB49细胞的抑制率。　　3.利用近红外（808nm，2 W/cm2）激光对不同浓度的rPEA@SPIONs溶液进行不同时间的照射。记录rPEA@SPIONs溶液温度随照射时间的变化，检测其光热转换性能。　　4.选取1mg/mL的rPEA@SPIONs溶液，近红外(808nm，2W/cm2)激光照射15min。关闭激光器，待溶液自然冷却至初始温度，再开启激光持续照射15min，如此循环四次，记录温度，检测其近红外光热稳定性。　　5.检测纳米材料的光热毒性，MB49细胞中加入不同浓度的rPEA@SPIONs，近红外(808nm，2W/cm2)激光照射15min。37℃，5％ CO2条件下继续孵育24h。加入MTT培养4h，检测OD490。　　6.建立小鼠MB49膀胱癌皮下肿瘤模型:将2×107/mL MB49细胞混悬液100μL注射于C57BL/6小鼠右后肢皮下。　　7.DOX/rPAE@SPIONs在磁场引导下的肿瘤靶向性评价:当小鼠肿瘤体积达到500mm3时，经眼眶静脉丛分别注射DOX和DOX/rPAE@SPIONs溶液，注射后立即在肿瘤表面加5000Gs的外部磁场。于48h后处死小鼠，取小鼠主要脏器和肿瘤组织进行离题成像，观察比较DOX荧光密度值。　　8.DOX/rPAE@SPIONs全身给药后的体内循环和器官分布:给药方法同方法7，于5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h处死小鼠(n=3)，取血、心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，PBS洗净，HPLC测定DOX的浓度。　　9.DOX/rPAE@SPIONs的体内抗肿瘤疗效评价:当皮下肿瘤平均体积达80mm3时，随机分为5组(n=6):PBS+NIR组、DOX+NIR组、rPAE@SPIONs+MF+NIR组，DOX/rPAE@SPIONs+MF组和DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR组。眼眶静脉丛进行药物注射后，立即在肿瘤表面加5000Gs的外部磁场，持续2h后激光照射肿瘤部位（808nm，0.5W/cm2，5mm，10min）。治疗后每两天测量肿瘤大小，20天后将小鼠处死、取肿瘤组织并称重，进行石蜡包埋、切片、HE染色及Ki67免疫组化。　　10.DOX/rPAE@SPIONs在动物水平的毒副作用评价:治疗期间，观察小鼠活动状态、称体重。治疗后第20天，取小鼠全血并收集血清，检测血清中ALT、AST、Cre、BUN、TBIL和LDH水平;收集小鼠心、肝、脾、肺、肾固定过夜，石蜡包埋、切片及HE染色、普鲁士蓝染色进行组织学检查。　　11.DOX/rPAE@SPIONs对肿瘤肺转移的疗效评价:静脉接种肿瘤细胞后（100μL，2×106/mL），将小鼠随机分为四组:PBS+NIR组、DOX+NIR组、rPAE@SPIONs+MF+NIR组，DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR组(n=12)。治疗方法同方法9(808 nm，0.5W/cm2，8mm，10min)。治疗后隔天观察小鼠精神活动状态、存活情况并称量体重，于治疗后第20天，每组处死5只小鼠，取心、肝、脾、肺和肾脏，称量肺脏重量后，用苦味酸固定液固定，其他组织4％ PFA固定后制成蜡块。剩余小鼠继续观察至治疗后60天，记录生存期并绘制生存曲线。　　结果:　　1.TEM图像和DLS结果显示rPAE@SPIONs纳米颗粒大小均一，粒径分布窄，基本呈球形，粒径为～200 nm。振动样品磁强计结果说明纳米颗粒具有超顺磁性，在一定磁场作用下能够发生定向移动。　　2.所有浓度的rPAE@SPIONs溶液的温度随着照射时间的延长而增高，且随着其浓度的增加，上升的幅度增大。同一空载溶液在循环四次反复照射后，温度仍能升高至先前水平。　　3.rPAE@SPIONs在10-1000μg/mL范围内显示了很低的细胞毒性。近红外光（808nm，1 W/cm2）照射15min后，rPAE@SPIONs的细胞毒性显著增加，且与纳米颗粒的浓度呈正相关。　　4.纳米颗粒在外加磁场介导下的肿瘤靶向性:对肿瘤组织进行离体成像结果显示，DOX/rPEA@SPIONs+MF组靶向传递更多的DOX分子至肿瘤部位，为DOX组的2.5倍，且能维持48h以上，心脏中药物分布明显减少。　　5.HPLC检测DOX/rPEA@SPIONs血液循环和器官分布结果显示，与DOX相比，注射DOX/rPAE@SPIONs组的小鼠肝和脾中具有较高的药物分布，肿瘤组织中药物分布明显升高，心脏中的药物分布显著减少，与上述离体成像结果一致。　　6.DOX/rPAE@SPIONs的体内抗肿瘤疗效评价:治疗后第20天，DOX/rPAE@SPIONs组平均肿瘤重量明显小于其他治疗组，抑瘤率达88.65％。肿瘤组织的HE染色结果显示，DOX/rPAE@SPIONs组肿瘤细胞破坏较严重，细胞分布疏散。　　7.DOX/rPAE@SPIONs在动物体内的毒副作用评价:不同治疗组小鼠的体重未见明显变化;与PBS组相比，DOX+NIR组ALT、TBIL及LDH水平稍高于PBS组，间接说明其肝脏及心脏功能轻度受损;HE染色结果显示，DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR组脏器未见明显异常，而其他四组的肺部均出现转移癌病灶。　　8.DOX/rPAE@SPIONs对肺转移癌疗效评价:PBS+NIR组小鼠在第6天时，即出现体重显著下降、精神萎靡、行动迟缓等恶病质的症状，第14天时均死亡。20天时肺组织苦味酸染色显示DOX/rPAE@SPIONs+MF+NIR组肺部肉眼可见转移病灶最少，生存期显著延长，体重变化平稳，在第60天时全部存活，组织HE染色除肺部外，未见其他转移病灶，而其他三组均出现不同程度的脏器转移。　　结论:　　本课题成功合成了包载阿霉素磁靶向性光热治疗纳米载药体系，动物水平验证了该体系对外在磁场具有很好的响应性，可以更有效的积累于肿瘤部位。基于该纳米载体本身具有良好的光热效应，在该体系基础上的联合化疗和NIR激发的光热治疗实现协同抗肿瘤作用，对膀胱癌转移的治疗显著，且纳米材料无毒副作用、生物相容性好，具有潜在的临床应用价值。