论文部分内容阅读
二恶英类化学物质是环境中存在的最严重持久性有机污染物之一,由于其强毒性、来源广泛、难以降解并在生物链中富集等特点,需要对环境中二恶英进行监测。传统的气质联用化学检测方法是公认的金标准方法,灵敏度高、定性和定量准确,可以分辨多种不同异构体,但是操作费时、复杂,且价格昂贵,不适合对大量样品进行检测,迫切需要建立快速的检测方法。生物学检测方法操作简便、快捷、费用低,并且能更准确的反应样品中二恶英类化学物质对生物体的影响,因此发展更加高效易行的二恶英类化学物质生物学检测方法是对传统化学检测方法的补充,具有很大的研究和应用价值。
由于以上原因,我们发展了竞争ELISA检测方法和基于二恶英致毒机理的三种体外结合检测方法。利用噬菌体抗体库技术筛选到两株特异性针对TCDD的单链抗体(Single chain variable fragment,ScFv)11ScFv和13ScFv,这两株单链抗体对TCDD的线性检测范围分别为1 ng-40 ng和0.5 ng-10 ng。该检测方法利用大肠杆菌表达抗TCDD的单链抗体,具有培养时间短、表达量大、成本低廉的优点。由于不需要进行化学酶标,因此最大限度的保留了单链抗体的结合活性。整个操作简单易行,并且借助96孔板能做到大批样品的检测,节约时间和人力。
基于二恶英的致毒机理,即二恶英与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)结合并进一步与芳香烃受体核转运蛋白(aryl hydrocarbon receptor nucleartranslocator,ARNT)形成的二恶英-受体蛋白复合物能特异性的结合含有二恶英反应元件(Dioxin-response element,DRE)的DNA序列,发展了三种不同的检测方法:a)利用表面等离子体共振技术检测,即固定含有DRE序列的DNA探针,通过表面等离子体共振技术实现对TCDD的检测,检测范围为0.30 pM~30.45 pM;b)阻碍17核酸外切酶消化的芯片检测,即利用二恶英-受体蛋白复合物与DNA序列的结合会阻碍T7核酸外切酶对固定于芯片表面的荧光探针的降解从而实现对二恶英类化学物质的检测,TCDD的线性检测范围为0.31~31.1nM;C)异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)荧光增强法检测,即利用标记了FITC的荧光探针与二恶英-受体蛋白复合物结合后能在FITC周围形成疏水的微环境从而导致FITC的荧光增强,来实现对二恶英类化学物质的检测,TCDD的线性检测范围为1~100 pM。这三种方法灵敏度较高、操作简单快捷,并且能实现对大量样品的快速检测,给出样品的毒性当量,对样品进行生物安全评估,为检测环境监测、食品检验等领域的二恶英提供了更好的方法。