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植物蛋白酶是细胞中水解肽链中肽键的重要酶类,在植物许多生命活动过程中发挥着重要作用。研究表明,植物丝氨酸羧肽酶(SCP)以及与其氨基酸序列相似的丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL),既参与催化蛋白水解反应、伤应答反应,也在芥子酰基苹果酸和油菜素内酯合成过程中起作用。然而,这类蛋白是否调节植物应答其它逆境胁迫反应还不清楚。我们课题组前期以中科院遗传发育研究所提供的拟南芥T-DNA插入突变体库筛选获得一株对低钾反应敏感的突变体,命名为kl58(K+lower mutant 58)。该突变体表现为低钾条件下植株小、侧根减少;通过Tail-PCR技术发现,T-DNA反向插入了KL58基因AT2G22920终止密码子最后一个碱基前第四个碱基处,KL58属于SCP类蛋白家族。RT-PCR分析证明,KL58在kl58中没有表达。然而后期多次重复实验发现,kl58在低钾胁迫下的表型不稳定。为揭示KL58的功能,研究了kl58在高铁、高锌、低锌等胁迫下的表型,结果显示,在这些胁迫下突变体与WT在生长和发育方面没有显著差别。构建了KL58pro::GUS载体,同时获得了阳性GUS转基因植株,对植株生长时期的各个部位进行组织化学染色,观察到KL58在幼苗的根部表达较高,在幼苗期的叶子中表达较低,在种子、果荚及花序结构中没有表达。构建了KL58基因融合绿色荧光蛋白(GFP)基因载体,研究KL58的亚细胞定位情况,证明KL58定位在细胞膜上。为确定KL58是否具有丝氨酸羧肽酶活性,构建了KL58-pET-28a原核表达载体,并且成功在细菌中诱导表达出了该蛋白,为测定其丝氨酸羧肽酶活性奠定了基础。同时,我们还利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9)技术进行了沉默拟南芥NAD激酶2基因(NADK2)的研究。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶和转录激活因子样效应因子核酸酶技术之后,发展起来的另一个基因组编辑新技术,它具有简便和精确定点编辑基因组DNA的特点。目前在人类细胞系和医学等方面应用比较多,而在植物基因组编辑中的应用较少。本研究利用CRISPR/Cas9技术修饰拟南芥合成NADP(H)的激酶基因NADK2,构建了可在两个位点同时修饰NADK2的载体,转基因得到的阳性植株表型明显,突变效率较高。筛选得到的T1代阳性苗共有97个株系,与NADK2 T-DNA插入缺失突变体nadk2类似表型的转基因株系有57个,其中叶片发黄且植株矮小的有17株;嵌合体即叶片一半黄,一半绿的有40株,表型不明显的有40株。初步统计,T1代阳性率为17.53%,嵌合率为41.23%。另外,用含两个gRNA构建的CRISPR/Cas9载体沉默NADK2T2代的表型和分子鉴定的结果一致。这些结果表明,CRISPR/Cas9技术能高效沉默拟南芥NADK2基因。