论文部分内容阅读
斜纹夜蛾(Spodoptera litura)属鳞翅目，夜蛾科，是一种世界性分布的多食性害虫，给农业生产造成了严重的经济损失。深入开展斜纹夜蛾生理生化机制研究，并在此基础上寻找有效防治方法已成为当务之急。硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)和过氧化物还原酶(Peroxiredoxin，Prx)属于硫氧还蛋白抗氧化系统，在清除生物体内活性氧族(ROS)过程中发挥重要作用。本论文研究了斜纹夜蛾SlTrx1、SlTrx2和SlPrx5在抗氧化过程中的功能，为斜纹夜蛾的防治提供新思路和方法。主要结果如下: 从斜纹夜蛾cDNA文库中筛选并克隆了两个硫氧还蛋白基因，分别为SlTrx1和SlTrx2。SlTrx1基因的开放阅读框为318bp，拟编码106个氨基酸;SlTrx2基因的开放阅读框为447bp，拟编码149个氨基酸，SlTrx2基因含有一个内含子，长度为116bp。二者同时含有一个典型的多聚腺苷酸信号序列(AATAAA)和一个polyA尾巴。氨基酸序列同源性分析结果显示，斜纹夜蛾SlTrx1与棉铃虫HaTrx的相似性高达98％;SlTrx2与家蚕BmTrx2的相似性高达87％。系统发育分析表明SlTrx1属于1家族，SlTrx2属于2家族。使用SWISS-MODEL软件对SlTrx1和SlTrx2的蛋白质结构进行模拟，获得了蛋白质的3D结构图，并标注了活性位点的位置。采用杆状病毒表达系统获得了可溶性重组蛋白SlTrx1和SlTrx2，经SDS-PAGE分析，重组SlTrx1的分子量约为14kDa;重组SlTrx2的分子量约为16kDa。重组蛋白具有还原胰岛素二硫键的活性，且重组SlTrx1和SlTrx2的最佳反应温度均为35℃，最佳pH值均为7.0。qRT-PCR研究结果表明，SlTrx1和SlTrx2基因在整个发育时期表达水平十分相似，在6龄幼虫中表现为表皮的表达量最高，中肠次之，脂肪体最低;蛹期在各组织中的表达量均维持在较低水平;成虫期表皮的表达量均迅速上升。另外，另外H2O2、过氧化氢异丙苯、茚虫威和氰氟虫腙均可上调SlTrx1和SlTrx2基因的转录水平。 从斜纹夜蛾cDNA文库中筛选并克隆出一个过氧化物还原酶5（SlPrx5），SlPrx5基因的开放阅读框为477bp，拟编码159个氨基酸，含有一个典型的多聚腺苷酸信号序列(AATAAA)和一个polyA尾巴。氨基酸序列同源性分析结果显示，斜纹夜蛾SlPrx5与柑橘凤蝶PxPrx5的相似性高达91％。通过系统发育分析，获得了系统发育图谱。使用SWISS-MODEL软件对SlPrx5的蛋白质结构进行模拟，获得了蛋白质的3D结构图，并标注了活性位点位置。采用杆状病毒表达系统获得了分子量为20kDa可溶性重组蛋白SlPrx5。重组SlPrx5具有分解H2O2和DNA的保护活性。构建了表达重组SlPrx5的E.ColiBL21菌株，并将含有不同浓度H2O2、过氧化氢异丙苯和CdCl2的滤纸处理该菌株和对照菌株。结果表明，表达重组SlPrx5的E.ColiBL21菌株抑菌圈直径均显著小于对照菌株。qRT-PCR研究结果表明，SlPrx5基因在6龄幼虫中脂肪体的表达量最高，表皮次之，中肠最低;蛹期各组织中的表达量均维持在低水平;成虫期脂肪体的表达量迅速上升，表皮的表达量迅速下降。另外H2O2、过氧化氢异丙苯、茚虫威和氰氟虫腙均可上调SlPrx5基因的转录水平。