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一、超级白介素-15的克隆和表达目的：构建超级白介素-15 (IL-15/sIL-15Ra复合物)原核表达质粒并通过蛋白表达和纯化得到超级白介素15蛋白；构建超级白介素-15真核表达质粒pCDNA3.1-Hyper IL-15,并验证其生物学功能；通过基因改造构建分泌能力更强,在体内维持时间更长的Minicircle-Hyper IL-15真核表达质粒,并验证其生物学功能。方法：1、超级白介素-15原核质粒的构建和蛋白表达。取C57BL/6小鼠肌肉组织,Trizol-氯仿法提取肌肉组织细胞的总RNA,逆转录成cDNA作为模板,利用所设计的特异性引物,进行PCR扩增,分别得到小鼠IL-15和IL-15可溶性受体(sIL-15Ra)目的片段,采用重叠PCR技术将IL-15和sIL-15Ra片段通过26个氨基酸的软连接连接成复合物片段,2%琼脂糖电泳鉴定扩增产物。将获得的IL-15/sIL-15Ra复合物连接到pET43.1原核表达载体中,于BL-21表达菌中自发表达,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白并验证表达蛋白的可溶性,纯化获得有功能活性的超级白介素-15蛋白,Western Blot检测所得纯化蛋白。2、超级白介素-15真核表达质粒pCDNA3.1-Hyper IL-15的构建和功能验证。取C57BL/6小鼠肌肉组织,Trizol-氯仿法提取肌肉组织细胞的总RNA,逆转录成cDNA作为模板,利用所设计的特异性引物,进行PCR扩增,得到小鼠IL-15和IL-15可溶性受体(sIL-15Ra)目的片段,采用重叠PCR技术将IL-15和sIL-15Ra片段通过26个氨基酸的软连接连接成复合物片段,2%琼脂糖电泳鉴定扩增产物。将获得的IL-15/sIL-15Ra复合物连接到pCDNA3.1真核核表达载体中,将获得的质粒转染3T3细胞,从而得到含有超级白介素-15真核蛋白的上清。用该上清刺激培养CTLL-2细胞,通过CTLL-2增殖实验验证超级白介素-15真核蛋白的功能。将pCDNA3.1-Hyper IL-15通过尾静脉高压水流动力学注射法(hydradynamic gene transfer)注射到小鼠体内,检测小鼠血清中IL-15的表达验证pCDNA3.1-Hyper IL-15的生物学功能。3、Minicircle-Hyper IL-15真核表达质粒的构建和功能验证。设计特定的引物将IL-15前面原有的信号肽用IgGx替代以增加蛋白的分泌,同时在启动子ATG前面添加kozark序列增强基因的表达,以Minicircle-Hyper IL-15为模板进行PCR,将获得的产物连接到PMD-19T simple T载体中经过测序验证后连接到购买的Minicircle的亲本质粒pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体中,在阿拉伯糖的诱导下亲本质粒产生带有目的基因的微环质粒Minicircle-Hyper IL-15,通过质粒大抽试剂盒进行质粒纯化。将Minicircle-Hyper IL-15通过高压水流动力学注射法注射到小鼠体内,检测小鼠血清中IL-15的表达验证Minicircle-Hyper IL-15的生物学功能。结果：经过测序验证,我们成功构建了重组超级白介素-15的原核表达质粒PET43.1-Hyper IL-15。通过蛋白的表达和纯化并通过western blot验证,我们获得了超级白介素-15蛋白。经过测序验证,我们成功构建了pCDNA3.1-Hyper IL-15真核表达质粒,转染了pCDNA3.1-Hyper IL-15的细胞上清饲养的CTLL-2细胞,其增殖水平明显高于对照组。小鼠注射了pCDNA3.1-Hyper IL-15质粒后血清中有较高的IL-15蛋白的表达。经过测序验证,我们成功构建了Minicircle-Hyper IL-15亲本质粒,亲本质粒在阿拉伯糖的诱导下能够产生带有Hyper IL-15的微环质粒。小鼠注射了Minicircle-Hyper IL-15微环质粒后血清中有较高的IL-15蛋白的表达。结论：我们获得了具有生物学功能的超级白介素-15蛋白以及真核表达质粒pCDNA3.1-Hyper IL-15和Minicircle-Hyper IL-15。二、超级白介素-15在生理状态下免疫功能的研究目的：探索超级白介素-15在生理条件下对小鼠免疫系统的影响。方法：1、分别将pCDNA3.1-空质粒、pCDNA3.1-IL-15、pCDNA3.1-Hyper IL-15真核表达质粒尾静脉高压水流动力学注射到小鼠体内,80ug/2ml,分别于4天后和2周后,取小鼠的血清以及脾脏和肝脏的淋巴细胞。用CBA试剂盒检测小鼠血清中IL-15以及Thl细胞因子IFN-γ、TNF-a的水平,用流式细胞术检测小鼠脾脏和肝脏的淋巴细胞亚群的比例和细胞数,通过流式胞膜和胞内染色检测各细胞亚群特别是CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞的活化状态。2、分别将Minicircle-空质粒、Minicircle IL-15、Minicircle-Hyper IL-15真核表达质粒尾静脉高压水流动力学注射到小鼠体内,30ug/2ml,4天后和2周后,取小鼠的血清以及脾脏和肝脏的淋巴细胞。检测小鼠脾脏和肝脏的淋巴细胞亚群的比例和细胞数,通过流式细胞术进行胞膜和胞内染色检测各细胞亚群特别是CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞的活化状态。3、分别将Minicircle-空质粒、Minicircle IL-15、 Minicircle-Hyper IL-15真核表达质粒尾静脉高压水流动力学注射到小鼠体内,1周后利用Ki-67试剂盒和EDU检测试剂盒检测各细胞亚群的增殖状态；Annexin V和7-AAD检测各细胞亚群的凋亡和死亡情况,对以上实验结果进行统计学处理分析。结果：1、pCDNA3.1-Hyper IL-15显著增加CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞的数量,明显促进CD8+T细胞的早期活化(CD69+)以及NK、NKT细胞的成熟和活化,增强肝脏T分泌IFN-y、TNF-a的能力,使血清中IFN-y、TNF-a水平升高。pCDNA3.1-Hyper IL-15的作用更优于pCDNA3.1-IL-15,但在体内只能维持1周左右的时间,2周时功能基本丧失；2、Minicircle-Hyper IL-15在2周时仍然具有很强的免疫激活功能,能够显著增加CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞的数量,明显促进CD8+T细胞的早期活化(CD69+)以及效应性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的形成,促进NK.NKT细胞的成熟和活化,增强肝脏T细胞分泌IFN-y、TNF-a的能力,Minicircle-Hyper IL-15的效果明显强于Minicircle IL-15。3、超级白介素-15主要通过促进脾脏和肝脏的CD8+T、NK和NKT细胞的增殖,同时维持脾脏和肝脏CD8+T细胞以及肝脏的NK和NKT细胞的生存,减少它们的凋亡和死亡,从而使它们在体内的数量增加。超级白介素-15虽然也略微地促进了CD4+T细胞的增殖,但是其凋亡也上升,因此对CD4+T细胞的数量影响不大。结论：1、超级白介素-15在小鼠生理状态下能够有效刺激免疫系统。它能够促进CD8+T、NK和NKT细胞的增殖和活化,并有效维持体内CD8+T细胞和肝脏NK细胞的生存,减少其凋亡和死亡,从而极大地增加了活化和成熟的NK、NKT细胞以及效应性CD8+T和记忆性CD8+T细胞的数量。2、Minicircle-Hyper IL-15质粒性能更优于pCDNA3.1-Hyper IL-15,在本实验中,Minicircle-Hyper IL-15质粒使用的剂量更小,维持时间更久,效果更明显。三、超级白介素-15对原发性肝细胞肝癌的治疗作用及其机制研究目的：探寻超级白介素-15对原发性肝细胞肝癌的治疗作用方法：分别采用2种方法建立小鼠原位肝癌模型：原位种植肿瘤细胞Hepal-6-luc模型和尾静脉高压水流动力学注射肿瘤细胞Hepal-6-luc模型。然后采用尾静脉高压注射Minicircle-Hyper IL-15质粒作为肿瘤治疗手段。分别观察治疗后,小鼠肝脏肿瘤的体积和数量。用流式细胞术检测小鼠脾脏和肝脏的淋巴细胞亚群的比例和绝对计数。分别用CD8中和性抗体和NK抑制性抗体清除小鼠体内CD8+T细胞和抑制小鼠体内NK细胞,然后建立小鼠原位肝癌模型,采用尾静脉高压注射Minicircle-Hyper IL-15真核表达质粒作为肿瘤治疗手段。观察治疗后,小鼠肝脏肿瘤体积。对以上实验结果进行统计学处理分析。结果：在小鼠尾静脉高压水流动力学注射模型中,结果显示结果显示超级白介素-15治疗组小鼠的肝脏肿瘤数量明显少于对照组。在小鼠原位肝癌种植模型中,结果显示超级白介素-15治疗组小鼠的肝脏肿瘤明显小于对照组。流式结果显示超级白介素-15注射组小鼠脾脏、肝脏的CD8+T细胞和NK细胞比例和数量明显增加。效应CD8+T细胞(CD62L-CD44hi)、记忆性CD8+T细胞(CD62L+CD44hi)激活的NK细胞(NKP46+NK)、成熟激活的NK细胞(CD43+NK)以及的比例和细胞数均明显升高。抗体清除CD8+T细胞治疗组,小鼠的肝脏肿瘤明显大于超级白介素-15治疗对照组,抗体抑制NK细胞治疗组,与空质粒治疗对照组相比没有显著性差异,提示,CD8+T细胞在抗肿瘤过程中都起着至关重要的作用。结论：超级白介素-15对小鼠原发性肝细胞肝癌具有抑制作用,而CD8+T细胞在超级白介素-15对小鼠肝细胞肝癌的抑制作用中发挥着至关重要的作用。其主要机制为通过促进CD8+T细胞的增殖和活化,使具有抗肿瘤作用的效应性CD8+T和记忆性CD8+T的比例和数量显著上升,同时增强CD8+T的功能,使其分泌的IFN-γ、TNF-α水平显著增高。超级白介素-15介导的抗肿瘤作用主要依赖于CD8+T细胞。