论文部分内容阅读
目的:利用Desert Hedgehog(Dhh)信号通路抑制剂Cyclopamine和激动剂Smoothened agonist(SAG),探讨Dhh信号通路对生精小管样结构重构的影响及作用机制。方法:将10日龄小鼠睾丸消化细胞进行三维(3 dimensions,3D)立体培养,通过添加Dhh信号通路阻断剂Cyclopamine、激动剂SAG,利用免疫荧光技术检测支持细胞(Sertoli cells,SC)、管周肌样细胞(Peritubular myoid cells,PTM)、睾丸间质细胞(Leydig cells,LC)、生殖细胞(Germ cells,GC)和层粘连蛋白来观察生精小管样结构重构情况;利用活细胞工作站观察生精小管样结构形成过程;利用免疫荧光技术检测睾丸间质细胞、支持细胞、管周肌样细胞、生殖细胞的增殖情况;用Real-time PCR检测Dhh信号通路下游信号分子mRNA表达水平;用Western Blot(WB)检测Dhh信号通路下游信号分子蛋白的表达水平,探讨Dhh信号通路在生精小管样结构重构中的作用及机制。结果:添加抑制剂Cyclopamine后,免疫荧光结果显示支持细胞失去极性,圆形的管周肌样细胞、睾丸间质细胞和生殖细胞零散分布;层粘连蛋白的分泌受到抑制。活细胞工作站结果显示细胞运动缓慢,或者不运动,没有明显细胞聚集现象。添加激动剂SAG后,免疫荧光结果显示部分具有极性的支持细胞聚集,有排列成单细胞层的趋势;管周肌样细胞伸长呈纺锤状,将支持细胞包绕其中;大量的睾丸间质细胞在管周肌样细胞的外侧部聚集;SAG促进层粘连蛋白的分泌,促进基膜的形成。活细胞工作站结果显示,有运动迅速的纺锤状细胞将聚集起来的细胞包绕其中。通过检测各类细胞增殖,我们发现Cyclopamine抑制睾丸间质细胞(P<0.05)、管周肌样细胞(P<0.05)、生殖细胞(P<0.05)、支持细胞(P<0.05)的增殖,而SAG能促进睾丸间质细胞(P<0.05)、管周肌样细胞(P<0.05)、生殖细胞(P<0.05)的增殖。Real-time PCR结果显示:抑制剂组与阳性对照组相比,受体Ptch1和Smo的表达无统计学差异,转录因子Gli1的表达显著下调(P<0.05);激动剂组与阴性对照组相比,Ptch1和Smo的表达无统计学差异,Gli1的表达明显上调(P<0.05)。Western blot结果显示:抑制剂组与阳性对照组相比,Gli1蛋白的表达减少(P<0.05);激动剂组与阴性对照组相比,Gli1蛋白的表达增多(P<0.05)。结论:1.Dhh信号通路与睾丸间质细胞、管周肌样细胞、生殖细胞增殖有关。2.Dhh信号通路通过调控Gli1的表达,影响体外生精小管样结构的形成。