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白介素-5(interleukin-5,IL-5)是由Takatsu于1980年发现的一种具有免疫调节功能的生物活性介质,其能诱导B细胞的增殖分化,促进成熟的B细胞分泌IgM和活化的粘膜B细胞分泌合成IgA,并参与调节嗜酸性粒细胞的活化、增殖和存活时间等作用,故IL-5在调节机体免疫功能,尤其是粘膜免疫方面起着十分重要的作用。目前人和多种哺乳动物的IL-5已经得到了较深入的研究,而对禽IL-5的研究则相当滞后,目前仅GenBank收录一个由Stuart avery预测的鸡IL-5序列,至今尚未见禽IL-5 cDNA成功克隆及其功能研究方面的相关报道。为此,本实验根据这条预测的鸡IL-5核苷酸序列进行了以下方面的研究:1.成功克隆了鸡IL-5基因cDNA根据Stuart avery所预测的鸡IL-5基因序列设计并合成了1对特异性引物,在国内外首次从ConA激活的鸡体内脾脏淋巴细胞中扩增出IL-5基因cDNA并对其各种生物信息进行了分析。结果表明:所克隆的鸡IL-5基因cDNA全长381bp,比Stuart avery预测的少30 bp,但整体蛋白编码框架未受影响,共编码126个氨基酸,其中N端22个氨基酸为信号肽,成熟肽分子量为12.14 Ku,与哺乳动物的同源性约为25%,而Stuart avery预测的蛋白与哺乳动物的同源性约为23%。鸡IL-5蛋白的4个α螺旋结构的大小和位置与人IL-5相比基本一致,相似的结构预示鸡IL-5可能执行和哺乳动物IL-5相似的功能。2.实现了鸡IL-5基因的原核表达将所扩增的基因克隆至pET-28a载体构建了鸡IL-5原核表达载体并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中通过IPTG的诱导成功实现了表达。表达的IL-5蛋白经镍柱亲和层析纯化和复性后,得到了纯化和复性的鸡IL-5蛋白,为进一步研究禽IL-5的生物学功能奠定了良好的基础。3.制备了鸡IL-5多克隆抗体利用纯化和复性的鸡IL-5原核表达蛋白做为抗原,和弗氏佐剂乳化混合后免疫成年兔,制备了兔抗鸡IL-5多克隆抗体,效价和特异性、敏感性均已达到今后实验的需要,为禽IL-5的进一步研究增加了新的物质基础。4.构建了鸡IL-5重组鸡痘病毒将鸡IL-5全基因连接到鸡痘病毒重组质粒pEF-gpt12S上构建了重组质粒pEF-gpt-IL-5。然后利用脂质体介导的方法将重组质粒和鸡痘病毒混合感染鸡胚成纤维细胞,利用选择性培养基筛选重组痘病毒。连续稀释纯化病毒后,通过PCR和Western blot检测,IL-5成功重组到了鸡痘病毒基因组上,并在重组痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞中得到了表达。为进一步研究禽IL-5的结构、生物学功能和作为新型的免疫佐剂奠定了良好的基础。