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黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科重要种传病毒之一,属我国潜在危险性有害生物,目前在检疫部门常有截获,在国内少数地区新近发现。本研究通过生物学鉴定及分子检测法确定了山东南瓜上的CGMMV分离物。
1)采集泰安郊区田间栽培的南瓜样品,根据CGMMV外壳蛋白基因序列的保守区域设计一对引物,在该样品上检测到CGMMV。扩增结果表明该目的片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因,序列分析表明该CP基因由486个核苷酸组成,编码161个氨基酸。序列比对发现,该分离物与来自辽宁的分离物同源性最高,为99.6%;与来自西班牙的分离物同源性最低,为91.6%。我们将该分离物命名为CGMMV-TANG。
2)设计7对引物,扩增到了CGMMV-TANG的全基因组序列,该分离物的全基因组由6424个核苷酸组成,编码4个大的蛋白,氨基酸数目分别为:1144、1648、264、161。序列比对发现CGMMV-TANG全基因组序列与韩国分离物的同源性最高,为99.6%;与西班牙分离物的同源性最低,为87.9%。
3)对包括该分离物在内的21个CGMMV分离物CP基因的核苷酸序列进行同源性比较和系统进化树构建,并结合寄主来源及地域来源进行起源分析,发现世界范围内不同的CGMMV分离物可以分为两个不同的组:Ⅰ、Ⅱ,每个组又可分为3个不同的亚组,不同组之间的同源性较低,不同分离物在分组上与地域来源有一定相关性。对CGMMV全基因组序列进行同源性比较和系统进化树构建,结果表明CGMMV分离物同样分为两个不同的组,并且不同的分离物在分组上与地域来源有一定相关性,分组结果与基于CP基因分组的结果基本一致。
小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus,ZYMV)在世界上50多个国家均有发生,是世界上危害葫芦科作物最严重的病毒之一。
1)根据ZYMV外壳蛋白基因序列的保守区域设计一对引物,通过RT-PCR法从山东刘集、山东昌乐自然感病西瓜以及河北沧州甜瓜上扩增得到了这三个分离物(ZYMV-LJ、ZYMV-CL和ZYMV-CZ)的外壳蛋白基因,序列分析表明这三个分离物的CP基因由840个核苷酸组成,编码279个氨基酸。序列比对发现ZYMV-CZ和ZYMV-LJ的同源性很高,为100%,ZYMV-CL与前两个分离物的同源性较低,仅为86.0%。
2)设计9对引物以及采用5’-RACE法扩增这三个分离物的全基因组序列,扩增得到了除5’端600 bp外的共9000 bp的片段。序列比对发现三者的同源性为92.5%-95.0%,ZYMV-CZ和ZYMV-LJ与韩国的分离物同源性最高,分别为96.3%、93.9%;ZYMV-CL与杭州的分离物同源性最高,为98.0%。
3)采用Lin的分类方法构建系统进化树,结果显示在世界范围内ZYMV分离物可以分为6不不同的基因型。沧州和刘集的分离物属于基因型V;昌乐的分离物属于基因型Ⅵ。