论文部分内容阅读
中梨1号为优质早熟梨新品种,具有较好的市场前景。但该品种不耐贮藏,在贮运过程中果实易衰老软化,失去其应有的商品特性,给梨生产和销售带来巨大损失。乙烯是重要的植物成熟激素,调控梨果实的成熟衰老过程,因此降低梨果实内源乙烯的合成,是延长果实贮藏、保鲜期的根本途径之一。利用反义RNA技术对乙烯合成的重要限速酶ACC氧化酶的基因表达进行抑制将会有效降低乙烯的内源合成。本研究以中梨1号为试材,建立了梨离体叶片不定芽再生体系和遗传转化体系,并通过农杆菌介导基因转化法成功将外源反义ACC氧化酶基因导入中梨1号,获得了转基因植株,填补了梨反义ACO基因遗传转化研究的空白,也为运用基因工程技术调控梨果实成熟衰老的研究提供了重要参考。本研究取得的主要结果如下:1.建立了高效、稳定的中梨1号叶片不定芽再生体系在苗龄为25～30d的继代试管苗上剪取顶部幼嫩平展叶片,垂直中脉刻伤后,远轴面向下接种于NN69+TDZ 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖20g/L的诱导培养基上,暗培养21d后转入光下正常培养,不定芽诱导率达85%,单叶出芽数2.72个;培养基中添加1mg/L的AgNO3可进一步提高不定芽再生率。2.构建了中梨1号ACC氧化酶基因反义表达载体根据已发表梨ACC氧化酶基因保守序列设计一对引物,以中梨1号成熟果实cDNA为模板扩增得到520bp的中梨1号ACC氧化酶基因cDNA片段,将此片段反向连接在pBI121质粒上构建ACC氧化酶基因反义表达载体,并进一步将表达载体转化农杆菌LBA4404。经质粒提取和PCR检测,该反义表达载体构建成功并已转化LBA4404,为下一步遗传转化研究提供了转化工具。3.优化了梨遗传转化体系选取中梨1号试管苗顶部平展幼嫩叶片,垂直中脉刻伤后远轴面向下接种在NN69+TDZ 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L再生培养基预培养2d,浸入OD600值0.5～0.6的农杆菌菌液中侵染10min,远轴面向上共培养2d后正向接入添加有200mg/L头孢噻肟钠的再生培养基进行杀菌和诱导培养,1周后转入添加5mg/L卡那霉素的再生芽选择培养基。待抗性芽长至1cm左右时,将芽转入添加20mg/L卡那霉素的抗性苗筛选培养基进行筛选。4.获得了27株中梨1号卡那霉素抗性植株,经PCR检测及Southern分析,其中3株为整合了目的基因片段的转基因植株。