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家蚕丝腺不但是蚕丝业的基础,而且其高效的蛋白质合成能力可被利用来开发新的生物产业,这被国际上誉为具有广阔应用前景的研究领域。家蚕丝蛋白合成关键基因的功能研究、家蚕丝蛋白合成机理研究和丝腺生物反应器的应用研究都需要家蚕丝腺细胞系作为研究平台,但至今还没有一个基因表达谱清楚的家蚕丝腺细胞系,它已成为制约这些研究的瓶颈。本论文利用家蚕全基因组芯片数据分析、RT-PCR和荧光定量PCR技术对家蚕丝腺细胞系BmSG-SWU1和丝腺组织的特异基因的表达谱以及细胞分裂周期基因的表达谱进行了分析,结果如下:
1.利用家蚕全基因组芯片对5龄3天雌、雄家蚕的丝腺和其它组织进行了18个丝腺特异表这基因的表达谱分析,芯片数据分析结果显示这些基因在5龄3天的家蚕丝腺组织中的表达量远高于在其它组织中的表达量。这18个基因中包括激素代谢相关蛋白、转运蛋白、蛋白修饰降解类磷酸化酶、脱氢酶及其它几种蛋白,它们可能与丝物质的分泌密切相关。
2.根据家蚕基因组芯片数据,分析了家蚕中与细胞周期调控相关的16个基因,包括周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinD、CyclinE、CyclinH及PCNA,周期蛋白依赖性激酶基因cdc2、Cdk2、Cdk5、Cdk6。这些基因大多在家蚕具有分裂增殖能力的幼虫精巢、卵巢中高量表达,而在处于高度分化状态的丝腺组织中低量表达。雌蛹到蛾的变态过程,也是卵巢减数分裂的旺盛期,这些基因的表达量逐渐变大。结果显示这一组基因与周期调控有关。
3.家蚕18个丝腺特异表达的基因的RT-PCR表明:在丝腺细胞系BmSG-SWU1中有部分丝腺特异表达基因表达,由此推测它仍然保留了丝腺组织细胞的部分特征。在18个基因中,有12个基因全部表达或都不表达;6个基因有较为明显的组织、细胞差异,其中有2个基因只在丝腺组织中有大量表达,而有3个基因在丝腺组织和丝腺细胞系BmSG-SWU1中的表达量要比精巢、卵巢高,但在BmN-SWU1中几乎不表达,另外有1个基因虽然在各个组织细胞中有表达差异,但差异不不大。
4.Fib-L和P25在不同组织细胞中的荧光定量PCR结果表明BmSG-SWU1细胞已经丧失了大量表达Fib-L和P25mRNA的能力。丝腺细胞系BmSG-SWU1中Fib-L和P25的表达量仅分别是丝腺组织的0.0013%和0.0048%,卵巢细胞系BmN-SWU1中Fib-L和P25的表达量分别是丝腺组织的0.0016%和0.0055%。两个细胞系表达这两个基因的水平基本一致,均远远低于丝腺组织的表达量。
5.预测的家蚕周期调控基因在家蚕不同组织和细胞系的RT-PCR结果表明:BmCyclinD2、BmcyclinEI、BmCyclinA1,BmCyclinx(含有Cyclinbox的未知周期蛋白基因)等四个周期蛋白基因在卵巢、丝腺、BmSG-SWU1、BmN-SWU1中都有较强的表达,而BmCyclinB和BmCyclinB3在丝腺组织中不表达。BmPCNA在四个组织、细胞内都有表达。这些结果暗示BmSG-SWU1细胞系重新启动了周期调控基因,以有丝分裂的方式进行细胞增值,而丝腺组织则是核内有丝分裂。
家蚕丝腺细胞系BmSG-SWU1经过长期的体外培养,已经从核内有丝分裂状态突破G2/M关键控制点重新进入了细胞有丝分裂周期,该细胞系虽失去了高量表达丝素基因Fib-L、P25的能力,但仍旧保留着表达原丝腺组织部分特异基因的能力,是一个保留了丝腺组织细胞的部分特征的细胞系。