电化学生物传感器作为一种分析和诊断的工具,可以将识别元件与分析物之间的特异性相互作用转换成易于处理的电信号,实现对分析物的定量检测。因具有操作简单、响应速度快、成本低、微型化等优点而被广泛应用于疾病诊断、药物发现、食品分析和环境监测等领域。近年来,随着DNA纳米技术的发展,将新型DNA纳米机器和诸多信号放大策略集成到电化学生物传感器的开发研究中对其灵敏度、特异性等性能的优化提升具有重要意义。立足于搭建更为灵敏、准确的检测平台,本论文设计组装了不同的DNA功能结构,并结合信号放大策略,提出了几种电化学生物传感新方法。具体工作如下:1.基于高效的目标物循环放大策略及网状Y形DNA结构构建电化学生物传感器的研究目标物循环放大策略可以显著提高生物传感器的灵敏度,但此策略往往存在循环产物浪费的缺陷。为克服该问题,我们在构建传感器时提出了一种高效的目标物循环放大策略,将所有循环产物充分用于网状Y-DNA的组装。同时,网状Y-DNA可调节四氧化三铁（Fe₃O₄）对亚甲基蓝（MB）的电催化作用,从而实现对目标DNA（与口腔肿瘤相关）的灵敏检测。具体来说,在限制性切刻内切酶的辅助下,目标DNA被循环利用,触发DNA链S1-Fe₃O₄@CeO₂-Pt和S2-MB的大量输出,输出的全部产物可与固定在电极表面的Hairpin2（HP2）链相互作用形成稳定的网状Y-DNA。此外,网状Y-DNA的形成使得Fe₃O₄@CeO₂-PtNPs靠近MB,调节了Fe₃O₄@CeO₂-PtNPs的电催化效率,电信号显著增强。借此设计,我们组建的电化学生物传感器实现了对目标DNA在10 fmol/L-50 nmol/L范围内的灵敏检测,检测限为3.5 fmol/L,也进一步促进了目标物循环放大策略在传感平台的发展。2.目标物驱动的双功能DNAzyme纳米机器用于比率型电化学生物传感器的研究多功能DNA纳米机器的构建往往是一项艰巨的任务,其繁多的DNA链和复杂的组装操作严重阻碍了多功能DNA纳米机器在生物传感平台中的进一步应用。本工作巧妙设计了一个简单的双功能DNAzyme纳米机器（BFDN）,并将其用于构建比率型电化学生物传感器实现高可靠性、高灵敏的汞离子(Hg²⁺)检测。在Hg²⁺存在的情况下,T-Hg²⁺-T配位作用可驱动无剪切能力的DNA四枝状纳米结构（DNA-4B）转化为具有强大剪切能力的BFDN,进一步触发两条同步的Hg²⁺检测路径。路径1,信号降低型路径,通过一个级联的DNAzyme剪切反应实现二茂铁（Fc）信号响应大幅减小;路径2,信号增强型路径,在BFDN中DNAzyme 2的辅助下将大量亚甲蓝（MB）捕获于电极表面实现信号增强。这样的双路径检测策略有效降低了传统单一检测路径中存在的假阳性信号,而且呈现了一种新的比率法可克服传统比率法电化学生物传感器的不足。最终我们的传感器可实现在0.1 pmol/L-200nmol/L范围内对Hg²⁺可靠且灵敏的检测,检测限为23 fmol/L。值得一提的是BFDN的构建巧妙地整合了放大策略,为提升多功能DNA纳米机器的性能提供了一种可参考的方式,也推动了多功能DNA纳米机器在生物传感器中的发展。3.基于3D DNAzyme分子马达构建电化学生物传感器的研究在生物传感平台,DNAzyme辅助的信号放大策略因DNAzyme成本低、稳定性好、特异性强而备具优势。但不可忽视的是DNAzyme辅助剪切过程中剪切效率低,反应时间长等缺陷仍然存在。本工作中,受当下高效的DNAzyme放大检测策略需求的驱动,我们结合DNAzyme多聚链以及纳米颗粒局域化DNA设计的优势成功组装了一种3D DNAzyme分子马达用于电化学生物传感器中实现目标物DNA的灵敏检测。3D DNAzyme分子马达由固定于Au@Fe₃O₄纳米颗粒（Au@Fe₃O₄NPs）表面的DNAzyme多聚链和底物H1-Fc构成。一方面,利用纳米颗粒局域化DNA同时提升了DNAzyme和底物H1-Fc的局部浓度,解决了传统DNAzyme放大检测策略中普遍存在的因反应物浓度低而抑制DNAzyme剪切的问题。另一方面,如步行器一样,3D DNAzyme分子马达中受目标物激活的DNAzyme多聚链可以自主的在底物H1-Fc形成的3D轨道上自由行走完成循环剪切任务。但与传统的DNAzyme步行器相比,目标物激活的DNAzyme多聚链无需进行复杂的序列优化即具有较好的灵活性和强大的剪切能力,克服了空间限制,能够同时剪切近处及远处的底物,从而输出大量的剪切产物以得到高的响应信号。基于这两方面的优势,我们所报道的3D DNAzyme分子马达解决了一些存在于DNAzyme放大的检测策略中的缺陷,实现了高效的DNAzyme放大检测,且该传感器可以在5 fmol/L至50 nmol/L范围内灵敏检测目标物DNA,且检测限为1.7 fmol/L。更有意义的是3D DNAzyme分子马达作为一种新的DNA机器,其强大的剪切能力还赋予了3D DNAzyme分子马达用于货物卸载潜力,也为未来组装各种功能的DNA机器提供了参考。