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高效、安全的基因递送载体的研究是目前基因治疗研究的主要难点之一。非病毒基因递送载体由于安全、易组装等特点备受国内外学者的关注。本课题结合非离子表面活性剂普朗尼克（Poly（ethylene glycol）-poly（propyleneglycol）-poly（ethylene glycol）,PEO-PPO-PEO）和阳离子树状高分子聚丙烯亚胺（Polypropylenimine,PPI）的特点,制备了混合共聚物载体系统（Mixed CopolymerSystem,MCS）,用于非病毒基因递送的研究。本文研究内容包括Pluronic-PPI合成和表征,MCS的制备及制备条件的优化;MCS作为绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2和虫荧光素酶报告基因pGL3-promoter递送载体的研究,选用的细胞包括人肺腺癌细胞SPC-Al、中国仓鼠卵巢细胞CHO、人胚肾细胞293T以及人乳腺癌细胞MCF7和对应的耐阿霉素耐药株细胞MCF7/Adr;采用加入特异性抑制剂的方法,考察MCS复合物的细胞内吞途径和转运机制;采用激光共聚焦技术观察MCS复合物进入细胞以及细胞内转运的过程;初步评价了P123-PPI作为化学合成siRNA递送载体的可行性。本文将Pluronic P123、L61和F127分别与第三代的阳离子树状高分子聚丙烯亚胺（PPI 1684Da）反应,合成了Pluronic修饰的聚丙烯亚胺,采用静电凝聚法（coacervation）制备MCS,对制备体系和混合方式进行了优化,制备条件优化为:涡旋时间为20s,制备介质为去离子水。以涡旋20秒为混合条件、在纯水中制备可得到平均粒径在100nm左右的复合物纳米粒。同时以粒径为指标考察了P123-PPI/P123/DNA混合共聚物载体系统的稳定性,N/P 20时复合物于室温下能稳定存在48小时,之后随着时间的延长,复合物逐渐聚集,粒径增大。对MCS载体系统的性质进行了考察,包括其压缩、包裹质粒DNA的能力、抗DNase I的酶解、抗肝素钠解离和血清解离的能力。结果显示,复合物在N/P比大于2时,即可完全压缩质粒DNA,抑制DNA的电泳行为;P123-2.5g-PPI在N/P比10时复合物可完全阻止浓度为0.4U/μg DNA的DNase I的降解作用;载体材料能够保护质粒DNA不受血清的解离作用,即使血清的浓度高至50%;复合物能否抗肝素钠的解离作用则与肝素钠的浓度密切相关,当肝素钠浓度低于0.075mg/ml时对复合物基本没有解离作用,当肝素钠浓度高于0.125mg/ml时,可完全解离复合物,游离P123的加入对抗肝素钠解离作用影响不大。MCS是由Pluronic修饰的聚丙烯亚胺、游离的Pluronic和治疗基因三种成分组成。采用静电凝聚法法制备MCS,测定其粒径和zeta电位,转染细胞,采用细胞流式法测定表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数,以阳性细胞百分率为指标,筛选MCS的最优各项组成。首先比较了P123-2.5g-PPI和PPI对SPC-Al细胞的转染能力的差异;考察了P123的加入对PPI转染能力的影响。结果显示P123-2.5g-PPI的转染能力远远强于PPI本身的转染能力;非血清条件下转染时P123的加入能够显著提高PPI的转染效率,但对P123-2.5g-PPI的转染能力有所降低;利用pEGFP-N2考察了MCS（P123-2.5g-PPI/P123/DNA）在血清存在与否条件下对SPC-Al、CHO、293T细胞的转染,比较不同处方条件下的转染效率的差异。结果显示,非血清存在条件下转染时,对于不同的细胞,P123的加入的影响不一样,对于SPC-Al和CHO细胞,P123的加入降低P123-2.5g-PPI的转染效率,而对于293T细胞,P123的加入增加P123-2.5g-PPI的转染效率。血清存在条件下转染时,P123的加入能够显著提高P123-2.5g-PPI对于三种细胞的转染能力,且当游离P123的浓度在0.0045%和0.0135%之间时,提高能力最强;利用表达虫荧光素酶的质粒pGL3-promoter定量考察了MCS（P123-2.5g-PPI/P123/DNA）在血清存在与否条件下对SPC-Al细胞的转染,结果与以pEGFP-N2作为报告基因时的结果一致;考察了胎牛血清和牛血清白蛋白的加入对转染效率的影响。胎牛血清和牛血清白蛋白的加入在一定浓度范围内（＜25%）升高MCS的转染效率,但浓度过高时（50%）反而抑制MCS的转染效率。利用MCS递送治疗质粒对MCF7/Adr细胞进行转染,能够显著提高耐药株细胞对罗丹明的摄取。选择最优载体系统,即由P123-2.5g-PPI、3 P123和质粒DNA组成的MCS,以SPC-Al细胞为模型细胞,采用加入细胞摄取特异性抑制剂的方法,考察MCS复合物进入细胞的内吞途径以及这些内吞是否能够导致有效的转染。选择的抑制网格蛋白介导（Clathrin-mediated endocytosis,CME）的内吞的手段包括:抑制剂氯丙嗪（Chloropromazine,CPZ）和高渗葡萄糖（0.45M）以及K+耗竭法;选用的抑制陷穴小泡介导的内吞（Caveolae-mediated endocytosis,CvME）的抑制剂包括FilipinⅢ和Genistein;选择的抑制巨胞饮（Macropinocytosis）的抑制剂为5-（N,N-Dimethyl）amiloride hydrochloride（DMA）。抑制某一内吞途径后,测定MCS复合物的内吞变化情况以及虫荧光素酶报告基因在细胞内的表达情况。结果表明在SPC-Al细胞中,K+耗竭、高渗葡萄糖和氯丙嗪分别将MCS复合物的内吞降低20%、45%和60%左右;CvME内吞抑制剂Filipin和Genistein分别将内吞降低50%和40%左右;巨胞饮抑制剂DMA对内吞没有显著影响。通过虫荧光素酶的检测考察不同内吞途径被抑制后转染效率的变化,结果表明K+耗竭和氯丙嗪分别将MCS复合物的转染效率降低45%和30%;CvME内吞抑制剂Filipin和Genistein分别将转染效率降低30%和56%左右;巨胞饮抑制剂DMA对转染效率没有显著影响。据此推断MCS复合物通过CME和CvME两种内吞途径进入细胞,且两种内吞均能导致有效的转染;巨胞饮途径则不参与MCS的内吞和转染。为了进一步证明这一推断,分别对MCS复合物和CME及CvME内吞标记物用荧光探针进行标记,用激光扫描共聚焦显微镜观察MCS复合物进入细胞后与内吞标记物的共定位情况,证明了MCS复合物主要是通过CME和CvME这两种途径进入细胞。内酶体-溶酶体系统、细胞骨架微丝和微管及摩托蛋白对细胞内的膜泡转运具有非常重要的作用,加入内酶体-溶酶体系统酸化抑制剂NH4Cl和Monensin、肌动蛋白解聚剂细胞松弛素D（Cytochalasin D,CytoD）、微管解聚剂诺考达唑（nocodazole,NCZ）和微管稳定剂紫杉醇（paclitaxel,PTX）、动力蛋白抑制剂原钒酸钠（sodium orthovanadate,SOV）和驱动蛋白Eg5抑制剂monastrol,测定SPC-Al细胞内表达的虫荧光素酶的活性,考察它们对于MCS复合物在SPC-Al细胞内转运的影响。结果表明内酶体-溶酶体酸化系统被抑制以后,MCS的转染效率急剧降低;SPC-Al细胞中加入肌动蛋白（actin）解聚剂后转染效率降低50%左右;微管解聚剂nocodazole使荧光素酶表达显著下降,而加入微管稳定剂paclitaxel后,细胞中荧光素酶的表达则几乎不受影响;加入原钒酸钠后细胞中的荧光素酶的活性降低35%左右,加入monastrol后荧光素酶活性基本没有变化。这些结果表明,内酶体-溶酶体系统、细胞骨架和摩托蛋白对于MCS复合物在细胞内的转运具有非常重要的影响。为了进一步证明内酶体-溶酶体系统和微管参与了MCS复合物在细胞内的转运过程,采用荧光共定位的方法考察了内吞复合物和内酶体-溶酶体系统及微管的相对位置,结果显示MCS复合物经由内酶体-溶酶体系统和微管向细胞核转运。本文进一步考察了Pluronic修饰的PPI树状高分子作为化学合成小干扰RNA（siRNA）递送载体的可能性。结果显示P123-PPI在非血清存在条件下,P123-PPI可以高效地将siRNA递送至敏感或耐药的肿瘤细胞内;以P123-PPI递送抑制多药耐药蛋白（p-gp）基因的siRNA至耐药肿瘤细胞内,能够显著降低多药耐药蛋白的表达水平;P123-PPI/siRNA治疗MCF/Adr细胞后能够显著提高细胞对罗丹明的摄取。