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目的探索刚地弓形虫排泄分泌抗原对调节性T细胞数量及功能的影响,探究刚地弓形虫排泄分泌抗原对Foxp3及其上游信号分子表达的影响,进一步研究Smad2/3/4和JAK3/Stats信号通路在刚地弓形虫排泄分泌抗原抑制调节性T细胞Foxp3表达中的作用。方法1.雌性6~8周龄和雄性8~10周龄C57BL/6小鼠按2∶1同笼,隔日检获阴道栓,即认定为孕0天(G0)。在妊娠第5天,孕鼠腹腔分别注射刚地弓形虫Chinese 1株排泄分泌抗原(ESA),PBS和RU486。在G18天,剖杀孕鼠,观察孕鼠的流产率。通过HE染色观察胎盘的结构改变;通过流式细胞术评估小鼠脾细胞中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞的比例;通过Western blot检测小鼠胎盘Foxp3蛋白的表达;从小鼠体内分离原代调节性T细胞,评估CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞抑制淋巴细胞增殖的功能(实验分组:PBS,ESA及RU486)。2.ESA在体外刺激小鼠淋巴瘤细胞株(EL4细胞),通过Western blot,q RT-PCR,流式细胞术和细胞免疫荧光检测Foxp3表达;通过Western blot观察ESA对EL4细胞Smad2,P-Smad2,Smad3,P-Smad3,Smad4,IL-2Rγ,JAK3,Stat3,P-Stat3,Stat5和P-Stat5表达的作用;通过细胞免疫荧光分析ESA对EL4细胞P-Smad3,P-Stat3及P-Stat5表达的影响(实验分组:OVA,Control及ESA)。3.运用Smad2 si RNA以及pc DNA3.1-Smad2,pc DNA3.1-Smad3,pc DNA3.1-Smad4,pc DNA3.1-Stat3,pc DNA3.1-Stat5等过表达质粒转染EL4细胞,通过Western blot检测ESA对Foxp3及其上游有关信号分子表达的影响(实验分组:OVA,Control,ESA,空质粒/非特异性si RNA,空质粒/非特异性si RNA+ESA,过表达质粒/特异性si RNA,过表达质粒/特异性si RNA+ESA)。4.TGF?RII激动剂(TGF-β1),CD3和CD28共同刺激细胞上调TGF?RII的表达,通过Western blot检测ESA对EL4细胞TGF?RII,Smad2,P-Smad2,Smad3,P-Smad3,Smad4和Foxp3表达的影响。ESA在体外刺激原代的调节性T细胞,通过realtime PCR分析TGF?RII,Smad4及Foxp3的m RNA表达水平;ELISA检测EL4细胞培养上清中TGF-β1的表达(实验分组:OVA,Control,TGF-β1,ESA,TGF-β1+ESA)。运用TGF-β1的中和抗体,阻断TGF-β1的表达,通过Western blot检测TGFβRII表达情况(实验分组:OVA,Control,ESA,ESA+TGF-β1中和抗体,TGF-β1,TGF-β1+TGF-β1中和抗体)。5.IL-2Rγ的激动剂(IL-2)刺激EL4细胞上调IL-2Rγ的表达。通过Western blot检测ESA对EL4细胞IL-2Rγ,JAK3,Stat3,P-Stat3,Stat5,P-Stat5和Foxp3表达的影响(实验分组:OVA,Control,ESA,IL-2,IL-2+ESA)。ELISA检测EL4细胞培养上清中IL-2的表达(实验分组:OVA,Control,IL-2,ESA,IL-2+ESA)。运用IL-2Rγ的中和抗体,阻断IL-2的表达,通过Western blot检测IL-2Rγ表达情况(实验分组:OVA,Control,ESA,ESA+IL-2Rγ中和抗体,IL-2,IL-2+IL-2Rγ中和抗体)。结果1.在妊娠早期,刚地弓形虫ESA能诱导孕鼠发生流产。ESA破坏胎盘正常结构,降低调节性T细胞数量和抑制功能。2.ESA抑制P-Smad2,P-Smad3和Smad4表达,从而负性调节Foxp3。分别过表达Smad2,Smad3及Smad4,均能部分抵消由ESA诱导Foxp3表达的下调,而Smad2 si RNA与ESA协同作用进一步抑制Foxp3的表达。3.ESA通过直接抑制TGF?RII的表达而不是通过下调TGF-β1的水平,抑制Foxp3表达。TGF?RII激动剂可以抵消由ESA诱导的Foxp3表达下调。中和TGF-β1后ESA仍然能显著减少TGF?R表达。4.ESA通过抑制IL-2Rγ的表达,从而下调JAK3,P-Stat3及P-Stat5,负性调节Foxp3表达。分别过表达Stat3和Stat5均能部分抵消由ESA诱导Foxp3表达的下调。IL-2激动剂可以抵消由ESA诱导的Foxp3表达下调。运用IL-2Rγ的中和抗体中和IL-2Rγ的表达后,ESA仍能减弱Foxp3的表达。结论1.刚地弓形虫Chinese1株ESA降低调节性T细胞数量和抑制功能。2.刚地弓形虫Chinese1株ESA通过直接抑制TGF?RII的表达,阻断Smad2/3/4信号通路,最终抑制Foxp3表达。3.刚地弓形虫Chinese1株ESA通过JAK3/Stats信号通路抑制Foxp3的表达。