急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是指缺血缺氧、感染、药物等各种原因导致的肾功能急剧恶化,从而引起全身多系统症状的一组严重临床综合征,病理表现为急性肾小管上皮细胞坏死。我们前期研究已证实线粒体功能异常在慢性肾脏疾病中发挥重要的作用,肾脏中尤其肾小管上皮细胞富含线粒体,线粒体功能障碍引起能量合成减少的同时伴有活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成增多。ROS能够诱导基因突变,使DNA链上的鸟嘌呤氧化为8-羟基鸟嘌呤（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG）,造成G:C突变成T:A,进而导致DNA突变引发疾病。但机体存在多种修复机制,其中碱基切除修复（BER）是比较保守且普遍存在的修复方式,人类mutY同源物（human mutY homolog,MUTYH）基因和人类mutT同源物1（human mutT homolog1,hMTH1）、人类8-羟基鸟嘌呤糖基化酶（human8-oxoguanine glycosylase 1,hOGG 1）互相协作共同完成8-OHdG的修复,维持DNA的稳定,其中MUTYH基因在BER系统中起主要作用。MUTYH基因变异将导致机体修复功能的下降,从而参与多种人类疾病的发生发展。人类MUTYH基因编码的蛋白存在不同的亚细胞定位,Ⅰ型蛋白产物定位于线粒体内,维持线粒体基因组（mtDNA）稳定;Ⅱ型蛋白产物定位于细胞核内,维持核基因组（nDNA）稳定。基于以上研究背景,提出假设:MUTYH可以通过修复线粒体DNA和细胞核DNA损伤减轻急性肾损伤。本课题通过基因敲除及过表达方法研究了 MUTYH在顺铂诱导的AKI中的作用;此外,使用线粒体呼吸链复合体Ⅰ抑制剂来探讨线粒体损伤在叶酸诱导的急性肾损伤中的作用。结果发现:（1）MUTYH基因敲除降低了小鼠肾脏线粒体基因组拷贝数,加重了顺铂诱导的肾功能衰竭、急性肾小管损伤、线粒体损害、细胞凋亡和炎症反应;（2）体内过表达Ⅱ型MUTYH有效改善了顺铂诱导的肾功能衰竭、急性肾小管损伤、细胞凋亡和炎症反应;体外转染Ⅱ型MUTYH能明显减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡并抑制ROS产生;体外过表达线粒体型（Ⅰ型）MUTYH可以减轻顺铂引起的细胞凋亡,但在体内仅观察到有限的肾脏保护作用;（3）线粒体呼吸链复合体Ⅰ抑制剂鱼藤酮（Rotenone）加重叶酸诱导的肾功能衰竭、急性肾小管损伤、线粒体损害、氧化应激、细胞凋亡和炎症反应。本研究结果提示,MUTYH对顺铂诱导的急性肾损伤有重要保护作用;线粒体功能障碍参与了急性肾损伤的发生和发展,保护线粒体功能将可能成为治疗急性肾损伤的有效策略。第一部分 MUTYH基因敲除加重顺铂诱导的急性肾损伤目的:探讨MUTYH基因敲除在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用及其对线粒体的影响。方法:给予C57BL/6小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂（cisplatin,Cis.）建立急性肾损伤模型。通过qRT-PCR和Western blot检测MUTYH表达的变化,免疫荧光共聚焦显微镜观察顺铂诱导AKI肾组织中8-羟基鸟嘌呤糖基化酶（8-OHdG）的表达。以C57BL/6背景的MUTYH基因敲除（MUTYH+/-）杂合子小鼠交配繁殖,获得MUTYH 野生型（MUTYH+/+）、MUTYH 杂合子（MUTYH+/-）及 MUTYH 纯合子（MUTYH-/-）小鼠。挑选8-10周雄性小鼠进行实验,分为6组:对照组为MUTYH+/+组、MUTYH+/-组、MUTYH-/-组,实验组为 MUTYH+/++cisplatin 组、MUTYH+/-+cisplatin 组、MUTYH-/-+cisplatin 组。实验组腹腔注射 20mg/kg 顺铂,对照组腹腔注射等体积生理盐水,于72小时后处死小鼠,观察肾脏大小、颜色变化等;检测血尿素氮、血肌酐浓度,PAS染色观察肾组织病理学改变,Western blot和qRT-PCR方法检测MUTYH、急性肾小管损伤指标中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和肾损伤分子（kidney injury molecule 1,KIM-1）的表达;提取肾组织基因组DNA,qRT-PCR检测线粒体DNA拷贝数;此外也检测了线粒体相关基因（TFAM、mt-COX1、mt-COX2、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CYTB、SOD2）和炎症指标TNF-α、IL-6、MCP-1的表达;通过肾组织TUNEL染色及凋亡相关蛋白BAX表达变化来评价细胞凋亡情况。结果:（1）在顺铂诱导的AKI模型中,Western blot结果显示肾脏组织中MUTYH蛋白显著下调,但qRT-PCR结果显示MUTYH基因表达明显上调（升高约1.5倍）;免疫荧光显示在顺铂诱导的AKI肾组织中,鸟嘌呤氧化产物8-OHdG表达增加。此外,MUTYH基因敲除鼠线粒体基因组拷贝数较正常小鼠明显减少,而线粒体基因mt-COX1和mt-ATP6与正常小鼠没有变化。（2）通过Western blot和qRT-PCR对繁殖的转基因小鼠进行基因型鉴定,MUTYH基因敲除杂合子和纯合子小鼠的肾组织中MUTYH蛋白和核酸水平的表达均显著降低。MUTYH基因鼠腹腔注射顺铂诱导急性肾损伤,使用血生化仪检测肾功能指标,MUTYH+/-组[（108.8±20.25）μmol/L,（55.23±4.16）mmol/L]和 MUTYH-/-组[（112.5 ±18.82）μmol/L,（67.65±4.02）mmol/L]小鼠的血肌酐和血尿素氮浓度升高的程度比MUTYH+/+组[（33.60±9.14）μmol/L,（37.83±4.99）mmol/L]更明显,同时肾脏的色泽更为苍白,肾组织病理学检查也发现更严重的肾小管上皮细胞坏死、基底膜裸露及肾小管扩张,急性肾小管损伤指标NGAL和KIM-1的表达也进一步升高。（3）在顺铂诱导 AKI 的肾脏中,TFAM、mt-COX1、mt-COX2、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CYTB、SOD2等线粒体相关基因表达明显降低,MUTYH基因敲除进一步下调了上述线粒体基因的表达水平。（4）MUTYH基因敲除显著增加了线粒体凋亡相关蛋白BAX的表达,与其相一致,TUNEL染色也显示了凋亡细胞数量的进一步增加;（5）qRT-PCR结果显示,顺铂诱导AKI肾脏中炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1的表达水平增高,MUTYH基因敲除进一步上调了炎症因子的表达。结论:MUTYH基因敲除加重了顺铂诱导的急性肾损伤,同时也导致和加重了线粒体功能障碍。第二部分 过表达Ⅱ型MUTYH减轻顺铂诱导的急性肾损伤目的:探讨过表达MUTYH在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用。方法:（1）选取8-10周C57BL/6雄性小鼠,20-25g,通过尾静脉快速（10s内）注射2ml含有60μg过表达质粒（对照组注射相同量的空载体质粒）的无菌生理盐水,分别将外源性MUTYH Ⅰ型和Ⅱ型质粒导入小鼠体内,通过qRT-PCR验证外源性目的基因在小鼠肾脏的表达;尾静脉注射质粒36小时后给予小鼠腹腔注射顺铂20mg/kg诱导急性肾损伤模型（对照组注射同等体积生理盐水）,实验分为四组:vector 对照组、vector+cisplatin 组、MUTYH Ⅰ 型+cisplatin 组和 MUTYHⅡ型+cisplatin组,注射顺铂后72小时处死小鼠,观察肾脏大小及颜色变化,检测血尿素氮、血肌酐浓度,PAS染色观察肾组织病理学改变,Western blot和qRT-PCR方法检测急性肾小管损伤指标NGAL和KIM-1、凋亡蛋白BAX以及炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1、ICAM-1的表达,肾组织免疫组化检测NGAL的表达,肾组织TUNEL染色观察组织细胞凋亡。（2）体外培养小鼠肾小管上皮细胞（mPTC）,应用不同浓度顺铂（1、5、10μg/ml）刺激mPTC,qRT-PCR、Western blot检测MUTHY表达的改变;给予mPTC瞬时转染MUTYH I型和Ⅱ型质粒,使用G418（400μg/ml）筛选2周后得到稳定表达目的基因的细胞株,通过免疫荧光共聚焦显微镜和Western blot验证目的蛋白的过表达,应用顺铂5μg/ml刺激mPTC,实验分为 3 组:vector+cisplatin 组、MUTYH Ⅰ 型+cisplatin 组和 MUTYHⅡ型+cisplatin组,AnnexinV-PI双染及流式细胞仪检测mPTC凋亡情况,采用荧光探针DCHFDA染料检测ROS的产生。结果:（1）经尾静脉快速注射含外源性MUTYH质粒的生理盐水后,qRT-PCR结果显示小鼠肾脏组织中MUTYH Ⅰ型比对照组升高约5.9倍,MUTYH Ⅱ型比对照组升高约6.8倍,证明通过尾静脉快速注射法能够在小鼠肾脏有效的过表达目的基因。（2）通过检测肾功能指标,结果显示过表达Ⅱ型MUTYH基因明显降低了顺铂处理小鼠的血清尿素氮和血肌酐水平,过表达vector、Ⅰ型MUTYH和Ⅱ型MUTYH小鼠发生AKI的血尿素氮和血肌酐浓度分别是[（39.62±2.88）vs.（53.97±7.97）vs.（17.78±3.51）mmol/L]和[（136.5±5.10）vs.（83.26±27.23）vs.（66.88±10.55）μmol/L]。过表达Ⅱ型MUTYH基因小鼠肾脏外观比过表达空载基因和Ⅰ型MUTYH基因的小鼠肾脏色泽更红润,肾脏组织PAS染色显示过表达Ⅱ型MUTYH基因明显改善顺铂诱导AKI的肾小管损伤,同时也下调了急性肾小管损伤指标NGAL和KIM-1的表达。（3）过表达Ⅱ型MUTYH基因明显降低了顺铂诱导AKI肾组织中促凋亡蛋白BAX的表达,其肾组织TUNEL染色结果也证实体内过表达Ⅱ型MUTYH显著抑制了顺铂诱导的细胞凋亡。（4）通过qRT-PCR检测发现过表达Ⅱ型MUTYH显著抑制了顺铂诱导的肾组织炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1、ICAM-1基因的表达。（5）过表达Ⅰ型MUTYH可以下调炎症因子TNF-α、MCP-1的表达,但对肾功能及肾小管损伤未产生显著的改善作用。（6）应用不同浓度的顺铂刺激小鼠肾小管上皮细胞,MUTYH蛋白表达呈剂量依赖性降低,而MUTYH基因表达则显著上调,提示可能存在转录后调控;细胞免疫荧光激光共聚焦结果显示Ⅰ型MUTYH定位在细胞线粒体,Ⅱ型MUTYH定位在细胞核内;因MUTYH质粒带FLAG标签基因,且三种质粒均有新霉素抗药性基因,经G418筛选稳定过表达目的基因细胞株,转染MUTYH质粒的细胞株的FLAG和MUTYH蛋白表达较空载组明显升高。（7）使用AnnexinV-PI双染标记经流式细胞仪检测结果显示过表达Ⅰ型和Ⅱ型MUTYH均明显抑制顺铂引起的细胞凋亡,Ⅱ型MUTYH较Ⅰ型MUTYH的抑制效果更为显著;同时,采用荧光探针DCHFDA染料经流式细胞仪检测ROS水平,结果显示过表达Ⅱ型MUTYH型能明显抑制顺铂诱导的ROS生成。结论:过表达Ⅱ型MUTYH能有效改善顺铂诱导的肾功能衰竭、急性肾小管损伤、细胞凋亡和炎症反应;而过表达Ⅰ型MUTYH虽然能够一定程度上减轻炎症反应及细胞凋亡,但是对肾功能的改善作用不显著。第三部分 线粒体呼吸链复合体Ⅰ抑制剂加重叶酸诱导的急性肾损伤目的:探讨线粒体呼吸链复合体Ⅰ抑制剂在叶酸诱导的急性肾损伤中的作用。方法:8-10周龄C57BL/6雄性小鼠,随机分为3组:对照组（碳酸氢钠注射液组）、模型组（叶酸组）、实验组（Rotenone+叶酸组）,实验组于造模前24小时开始喂食含rotenone（200ppm）食物,24小时后,模型组一次性腹腔注射叶酸（240 mg/kg）诱导急性肾损伤,对照组腹腔注射同等体积的碳酸氢钠溶液[0.3M),注射叶酸72小时后处死小鼠,检测血清尿素氮、血肌酐浓度,肾脏PAS染色观察肾组织病理学改变;采用Western blot检测急性肾小管损伤指标NGAL、氧化应激指标HO-1和SOD2以及促凋亡蛋白BAX的表达;qRT-PCR检测线粒体基因mt-COX1、mt-ND1 及 NGAL、HO-1 和炎症因子 IL-6、ICAM-1 的 mRNA 水平;提取肾组织基因组DNA,应用qRT-PCR检测mtDNA拷贝数;使用MDA试剂盒检测肾组织中MDA浓度;TUNEL染色观察肾脏细胞凋亡;ELISA试剂盒检测血清TNF-α的含量;此外,通过检测正常小鼠和喂食含rotenone（200ppm）食物小鼠的体重变化及血清ALT、AST、BUN、Scr和LDH浓度来评估rotenone对小鼠肝、肾、心功能的影响。结果:（1）与对照组比较,叶酸处理小鼠的肾功能指标血清肌酐、血尿素氮浓度均明显升高,喂食Rotenone则进一步加重了叶酸诱导的急性肾功能衰竭。对照组、模型组和实验组的小鼠血尿素氮和血肌酐浓度分别是[（10.32±0.68）vs.（18.09±2.04）vs.（121.0±2.91）mmol/L]和[（31.80±3.92）vs.（67.40±9.24）vs.（368.1±21.23）μmol/L]。肾组织PAS染色显示Rotenone预处理小鼠的肾小管上皮细胞萎缩、管腔扩张更明显,病变范围更广,肾小管间质损伤评分进一步升高,qRT-PCR和Western blot结果也显示NGAL表达进一步上调。（2）在叶酸处理的小鼠肾脏组织,mtDNA拷贝数明显减少,Rotenone进一步加重了mtDNA拷贝数的下降,同时线粒体基因mt-COX1、mt-ND1的表达也进一步降低。（3）Rotenone显著增加了叶酸处理小鼠肾脏组织MDA的水平,上调了血红素氧合酶1（HO-1）的表达,并降低了抗氧化剂SOD2。（4）在Rotenone处理的AKI小鼠肾脏组织,TUNEL染色阳性细胞数显著多于叶酸处理组,凋亡相关蛋白BAX的表达水平也显著增加。（5）叶酸处理小鼠肾组织中的IL-6、ICAM-1水平和血清TNF-α水平均明显升高,Rotenone进一步上调了IL-6的表达（6）为了评估Rotenone的安全性,检测了喂食Rotenone（200ppm）小鼠的体重、肾功能、肝脏及心肌酶学指标,结果显示与正常小鼠相比无异常变化。结论:通过线粒体呼吸链复合体Ⅰ抑制剂Rotenone抑制线粒体功能进一步加重了叶酸诱导的急性肾损伤,提示线粒体功能障碍参与了AKI的发生。